Ｃ５位上羟基对染料木黄酮抑制重组人蛋白激酶ＣＫ２活性的影响

【摘要】 目的 观察染料木黄酮C5位上的羟基对其抑制重组人蛋白激酶CK2全酶活性的影响。方法 将利用基因工程技术获得的重组人CK2α’及β亚基在体外等摩尔混合构成CK2全酶。通过测定药物作用后转移到CK2底物上的［γ32P］ATP的32P的放射性活度，探讨染料木黄酮和大豆甙元对重组人CK2全酶活性的抑制作用，并采用半数效量概率单位法计算其IC50值。结果 染料木黄酮和大豆甙元能明显抑制重组人CK2全酶活性，其IC50值分别是27.95 μmol/L和2.38 μmol/L，作用效果接近或者强于目前已知的CK2抑制剂N(2氨乙基)5氯萘1硫胺 (A3)。结构效应分析表明：C5位上的羟基可减弱染料木黄酮对重组人CK2全酶的抑制作用。结论 染料木黄酮和大豆甙元是两种有效的重组人CK2全酶的抑制剂。

【关键词】蛋白激酶CK2；全酶；染料木黄酮；IC50文章编号：1003-1383(2008)01-0001-04

中图分类号：R284.1; R329.2; R345.57; R916.4; R977.3 文献标识码：A

Effect of 5 hydroxyl group of genistein on  recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme activity

LIN Xiaocong1，LIU Xinguang1，LI Chunmei2，CHEN Xiaowen3

(1.Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023, China; 2. Department of Biochem istry,Guangdong College of Pharmacy, Guangzhou 510240, China; 3. Pediatrics Institute ofShenzhen Children"s Hospital, Shenzhen 518026, China)

【Abstract】 Objective To observed the effects of 5 hydroxyl group of genistein on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme activity.

Methods Recombinant human protein kinase CK2α’and β subunits which were abtained by genetic engineering tecnology were mixed into reconstitute CK2 holoenzyme. the effects of 5 hydroxyl group of genistein on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme activity was study by detecting incorporation of 32P of ［γ32P］ATP.

Results Genistein and daidzein were shown to inhibit obviously recombinant CK2 holoenzyme activity in a concentrationdependent manner with IC50  values of 27.95，2.38 μmol/L，respectively，which display a close effect or more potent than previously known inhibitor N(2aminoethy1)5chloronaphthalene1sulfonamide (A3). Structureactivity study indicated that hydroxyl group at position 5 is detrimental per se for the inhibitory effects of genistein on CK2.

Conclusion Genistein and daidzein were two effective inhibitors of recombinant human protein kinase CK2 in vitro.

【Key words】 protein kinase CK2; holoenzyme; genistein; IC50

蛋白激酶CK2 是一种高度保守的第二信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶。全酶是由两个催化亚基(α或α’) 和两个调节亚基(β)组成的不均一四聚体(α2β2，α’2β2 或αα’β2 )［1，2］。CK2的α和α’基因是原癌基因［3］。在多种实体瘤细胞和白血病细胞中，CK2活性比相应的正常组织中高3～8倍［4，5］。转基因小鼠淋巴细胞中的CK2α亚基的失控表达可导致淋巴瘤，CK2α亚基与原癌基因cMyc共表达或在p53表达被改变条件下，CK2α基因的表达可促进急性淋巴细胞性白血病的发生［2］。此外，CK2 与HIV1 的生命周期关系十分密切，它可在HIV1 的复制、转录及裂解细胞等功能的调控中起重要作用，一些CK2 抑制剂具有抗HIV1 活性［6］。Sarno等［7］指出，CK2在寻找抗肿瘤及抗病毒药物方面是一个具有吸引力的分子靶点，其特异性抑制剂具有潜在的临床应用价值。

黄酮类化合物具有抗炎、抗病毒、抗氧化、利胆、强心、镇痛和抗肿瘤等多种生物学活性并与蛋白激酶※基金项目：教育部科学技术研究重点项目(No 200303096)；广东省科技计划项目(No 2001011766)；广东省卫生厅医学科研基金项目 (No A2004454)

作者简介：林小聪（1975-），男，广东省湛江市人，生物化学讲师，硕士。研究方向：蛋白激酶CK2的生化药理学。 通讯作者：刘新光(1964-)，男，江西省九江市人，生物化学教授，博士，博士研究生导师。关系密切；多种黄酮类化合物能抑制蛋白激酶的活性［8］。染料木黄酮和大豆甙元作为两种结构非常相似的黄酮类化合物（结构式见图1），它们可能会影响CK2的活性。因此我们选择染料木黄酮和大豆甙元作为研究的对象，在已克隆、表达和纯化人CK2α’及β亚基的基础上［9～11］，探讨其对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用，并观察C5位上的羟基对其抑制作用的影响，为进一步寻找新型的抗肿瘤和抗病毒药物奠定基础。

材料与方法

1.材料和试剂 染料木黄酮和大豆甙元购自Aldrich公司；P81磷酸纤维素滤纸为Whatman公司产品；［γ32P］ATP为北京福瑞生物医学工程公司生产。其余为国产分析纯试剂。

2.实验仪器 GB2002型电子分析天平为MettlerToledo仪器上海有限公司产； LS6000SC型液闪计数仪为Beckman公司产；UV2100型分光光度计为尤尼柯上海仪器有限公司产。

3.克隆、表达和纯化人CK2α’和β亚基 人CK2α’和β亚基cDNA重组质粒pTCKA"和pTCKB的克隆与测序见我们以前的报道［9，10］。重组人CK2α’和β亚基的原核表达、纯化与鉴定见我们以前的报道［9，11］。

4.体外重组人CK2的蛋白定量 按常规的考马斯亮蓝R250染色法，以牛血清白蛋白作为标准［12］。

5.体外重组人CK2的活性测定 酶反应总体积为35 μl，反应混合液中含：50 mmol/L TrisHCl，150 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，10 μmol/L ATP，［γ32P］ATP 1.85×104Bq(比活1.85×1017Bq/mol)，去磷酸化酪蛋白2 g/L，pH 7.2。反应温度为30℃。将纯化的重组人CK2α’与β亚基按等摩尔(14 pmol)混合构成重组人CK2全酶。加重组CK2全酶10 μl启动酶反应，反应10 min后取30μl点至直径2 cm的P81磷酸纤维素滤纸上终止反应，阴干，用85 mmol/L 磷酸洗涤8次，最后用丙酮洗涤1次，80℃烤干后，加闪烁液于液闪仪计数，每组同时做3个平行管。

6.染料木黄酮和大豆甙元对重组人CK2全酶的直接作用及半数抑制浓度(IC50)的计算 将纯化的重组人CK2α’与β亚基按等摩尔(14 pmol)混合构成重组人CK2全酶。在每个反应管中分别加入10 μl不同浓度的受试化合物，加入15 μl反应混合液，以10 μl全酶启动反应从而观察受试化合物对CK2全酶活性的影响。IC50的计算根据半数效量概率单位法［13］进行。以浓度的对数为横坐标，相应浓度抑制率的概率单位(probit)为纵坐标，求出直线回归方程，并根据方程计算IC50值(50%抑制时的概率单位为5)。

7.统计学处理 以SPSS 11.0软件做统计学数据处理，实验结果用-±s表示，多组资料采用oneway ANOVA分析，组间的比较用Dunnett"st检验。

结果

1.染料木黄酮和大豆甙元对重组人CK2全酶的直接作用 将纯化的重组人CK2α’与β亚基按等摩尔(14 pmol)混合构成重组人CK2全酶，以2 g/L去磷酸化酪蛋白作为底物，向反应体系中分别加入不同浓度的染料木黄酮和大豆甙元测定CK2的活性。实验结果表明，染料木黄酮和大豆甙对CK2有较明显的抑制作用，且随着浓度的不断增加其对CK2全酶的抑制率逐渐上升，呈现浓度依赖性关系（见表1和表2）。

2.染料木黄酮和大豆甙元对重组人CK2全酶直接作用的半数抑制浓度(IC50) 根据染料木黄酮和大豆甙元对重组人CK2活性抑制作用的结果，以浓度的对数为横坐标，相应浓度抑制率的概率单位(probit)为纵坐标（见图2和图3），求出直线回归方程分别为：Y=1.509X－1.7227， r2=0.9924 （染料木黄酮）；Y=0.3402X+3.9237， r2=0.9902（大豆甙元）。根据50%抑制率时概率单位为5，利用回归方程计算相应的结果分别为27.95μmol/L和2.38 μmol/L。由此可见，大豆甙元对重组人CK2全酶活性的抑制效果要强于染料木黄酮。

讨论

蛋白激酶CK2是一种多功能的丝/苏氨酸蛋白激酶。有学者指出，CK2可能是肿瘤和艾滋病治疗的分子靶点之一，其特异性抑制剂具有潜在的临床治疗价值［7，14］。CK2又是一种多底物的蛋白激酶，迄今已发现其有300多种底物。CK2的许多底物如蛋白激酶A(PKA)、P34cdc2、P53、糖原合酶、钙调蛋白、乙酰COA羧化酶、雌激素受体2、热激蛋白90(HSP90)、酪蛋白磷酸酶1B以及胰岛素受体底物1（IRS1）等参与信号转导途径［4］。其中，钙调蛋白、p34cdc2和雌激素受体2，既可受PKC调节，又是CK2的重要底物［4，15］。此外，细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)以及糖原合酶激酶3(GSK3)等多种细胞代谢调节激酶的催化亚基与CK2的α 和α’亚基具有高度的同源性［15］。这些揭示了某些信号转导、细胞代谢调节的激酶与CK2之间存在密切的相互关系，因此这些激酶的抑制剂均可作为CK2抑制剂的筛选化合物。

由于CK2在细胞内的含量较低，而且从组织中提取纯化较为困难，因此我们通过基因工程方法获得大量有生物学活性的重组人CK2［9～11］，然后将纯化的重组人CK2α’与β亚基按等摩尔(14 pmol)混合构成重组人CK2全酶。全酶的性质鉴定表明重组人CK2全酶具有与天然CK2一致的性质，如可以酪蛋白作底物；而用碱性蛋白组蛋白ⅢS和TPK的底物Poly(Glu：Tyr)4∶1作底物时，CK2的活性则很低。另外，重组人CK2全酶的活性受到肝素和CK2特异性抑制剂DRB的抑制，精胺则有激活作用；而一些第二信使分子，如cAMP、cGMP和Ca2+则对CK2的活性基本没有影响［16］。我们以此作为基础来研究染料木黄酮和大豆甙元对重组人CK2全酶活性的影响。

N(2氨乙基)5氯萘1硫胺(A3)是目前公认的对CK2有抑制作用的化合物［1，4］，我们以前的研究表明［17］， A3对重组人CK2全酶有较强的抑制作用，其IC50值为25.5 μmol/L。本实验结果表明：染料木黄酮 (IC50=27.95 μmol/L) 和大豆甙元 (IC50=2.38 μmol/L) 能明显抑制重组人CK2全酶活性并呈浓度依赖性关系，其作用效果接近或者强于A3。由于染料木黄酮和大豆甙元结构非常相似（两者仅相差一个C5羟基）；通过比较两者对CK2的抑制效果，我们发现大豆甙元对CK2的作用效果要明显强于染料木黄酮，说明C5位上的羟基可减弱染料木黄酮对重组人CK2全酶的抑制作用，可能是此类CK2抑制剂的非必需基团。根据这些抑制剂的结构特点及其作用规律，借助计算机辅助设计并利用化学方法（如通过消除一些非必需基团）在某些基本化合物的基础上进行改造，我们可能会获得一些更有效的CK2抑制剂。此外，本实验结果也提示了染料木黄酮和大豆甙元是两种有效的重组人CK2全酶的抑制剂。

参考文献

［1］Litchfield DW. Protein kinase CK2: Structure, regulation and role in cellular decisions of life and death ［J］.Biochem J, 2003，369: 1-15.

［2］黄功华，刘新光，梁念慈.蛋白激酶CK2的研究进展［J］.生命的化学, 2003，23: 169-171.

［3］Xu X，Landesman-Bollag E，Channavajhala PL，et al. Murine protein kinase CK2: gene and oncogene ［J］.Mol Cell Biochem, 1999，191: 65-74.

［4］Pinna LA. Protein kinase CK2: a challenge to canons［J］.J Cell Sci, 2002，115: 3873-3878.

［5］Filhol O，Martiel J L，Cochet C.Protein kinase CK2: a new view of an old molecular complex［J］.EMBO Rep, 2004，5: 351-355.

［6］李春梅，刘新光，梁念慈.蛋白激酶CK2与HIV的生命周期［J］.国外医学临床生物化学与检验学分册, 2002，23: 208-211.

［7］Sarno S，Moro S，Meggio F，et al. Toward the rational design of protein kinase casein kinase-2 inhibitors［J］.Pharmacol Ther, 2002，93:159-168.

［8］黄华艺，查锡良.黄酮类化合物抗肿瘤作用研究进展［J］.中国新药与临床杂志, 2002，21:428-433.

［9］陈小文，刘新光，梁景耀，等.人蛋白激酶CK2α’亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化及性质鉴定［J］.中国生物化学与分子生物学报, 2004，20: 176-182.

［10］刘新光，梁念慈，马涧泉, 等. 重组人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与测序［J］.中国生物化学与分子生物学报, 1999，15:228-231.

［11］刘新光，梁念慈，马涧泉.重组人CK2β亚基的原核表达、纯化与鉴定［J］.生物化学与生物物理进展, 2000，27: 201-205.

［12］吴耀生. 新编生物化学实验［M］.北京: 人民卫生出版社，2002，39-40.

［13］杨树勤. 中国医学百科全书——医学统计学［M］.上海: 上海科学技术出版社, 1985，197-202.

［14］Guerra B，Boldyreff B，Sarno S，et al.CK2: A protein kinase in need of control ［J］.Pharmacol Ther, 1999，82:303-313.

［15］Blanquet PR. Casein kinase 2 as a potentially important enzyme in the nervous system［J］.Prog Neurobiol, 2000，60: 211-246.

［16］林小聪，刘新光，阮 杰，等.黄色黄素抑制人白血病HL60细胞内蛋白激酶CK2的实验研究［J］.生物化学与生物物理进展, 2007，34: 187-195.

［17］刘新光，梁念慈.AG1109对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用［J］.癌症, 2002，21:153-157.

(收稿日期：2008-01-04 修回日期：2008-01-22)

(编辑：潘明志 英文审校：钟京梓)

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。