濒危鱼类稀有白甲鱼染色体核型分析

摘要 以稀有白甲鱼头肾組织为材料，采用腹腔注射植物血细胞凝集素（PHA）、秋水仙素和空气干燥法制备染色体标本，进行染色体核型分析。结果表明：稀有白甲鱼染色体为50条，核型公式为2n=50，12m+16sm+10st+12t，NF=78。未发现异型染色体、随体染色体和次缢痕；其核型符合典型的低位类群鱼类核型特征。

关键词 稀有白甲鱼；染色体；核型

中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）08-0242-02

Chromosome Karyotype Analysis in Endangered Species Onychostoma rara

RAN Guang-xin 1 DAI Ying-gui 2 LUO Hao-xiang 1

（1 Southwest Guizhou Vocational & Technical College For Nationalities，Xingyi Guizhou 562400； 2 College Of Animal Sciences，Guizhou University）

Abstract Karyotype of Onychostoma rara was studied with chromosome samples prepared from head kidney by PHA，colchicine injection and air-dried method.The results showed that there were 50 chromosomes in O.rara and its karyotype formula was 2n=50，12m+16sm+10st+12t，NF=78.There was no evidence of heterotypical chromosome，satellites or secondary constriction.The karyotype of O.rara was in accordance with the lower group of fish evolutionary taxonomy.

Key words Onychostoma rara；chromosome；karyotype

稀有白甲鱼（Onychostoma rara）隶属于鲤形目鲤科鲃亚科的白甲鱼属，其仅分布于我国长江中游沅江水系和西江水系。该鱼类属中大型淡水食用经济鱼类，常栖息于河流中下层，以锐利的下颌角质缘刮食砾石表面的藻类为食，其肉味鲜美，营养价值较高。稀有白甲鱼作为一种野生淡水经济鱼类，其具有较高的食用经济价值和营养价值以及较大的驯养开发潜力[1]。

迄今，有关鱼类染色体核型的研究，已有较多的报道[2-7]。鱼类核型的研究，旨在了解鱼类遗传学特征、鱼类的分类地位及其演化历程，而目前对稀有白甲鱼核型的研究尚未见报道。该文开展稀有白甲鱼的核型研究，确定其染色体数目及其核型模式，拟为研究稀有白甲鱼的进化地位、遗传育种和种群关系以及对其保护和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料于2010年10—12月采自沅江水系贵州境内清水江，为性腺发育成熟的野生稀有白甲鱼9尾，体长为（225.6±12.8）mm，体重（410.8±36.2）g，均为雄性。

1.2 试验方法

1.2.1 预处理。按6 μg/g·体重，向试验鱼腹腔注射PHA，注射后在室内暂养20 h，最后按2.5～3.5 μg/g·体重向鱼体腹腔注射秋水仙素，再培养6 h。

1.2.2 细胞收集。将试验鱼进行尾部放血致死，然后打开腹腔，取其头肾于装有0.75 %鱼用生理盐水的培养皿中。用镊子将肾组织反复清洗至生理盐水无血色，再取出置于10 mL离心管，用镊子反复撕夹，使其中的游离细胞全部释放出来以制成细胞悬液，用尼龙纱绢过滤，再用吸管吸取细胞悬液于另一离心管中。

1.2.3 低渗。将收集于离心管的细胞悬液离心（离心速度1 000 r/min）30 min，离心后弃去上清液，加入0.075 mol/L KCl低渗液用吸管吹打均匀，然后低渗60 min。低渗结束直接离心（离心速度1 000 r/min）20 min。

1.2.4 固定。弃去上清液，然后顺管壁加入新配制的固定液，用吸管吹打均匀，置于室温条件下固定45 min，离心（离心速度1 000 r/min）20 min，弃去上清液，然后再固定，离心。

1.2.5 滴片。离心后，吸去上清液，加入5 mL固定液，用吸管吹打均匀后，吸取滴片。

1.2.6 染色。用pH值=7.2的磷酸盐缓冲液按10%的浓度配工作染液。将干燥过的滴片置于染色缸染色，时间60 min。

1.2.7 镜检拍照分析。将染色后的玻片镜检并拍照；按Levan等[8]的染色体分类标准作核型图分析。

2 结果与分析

2.1 稀有白甲鱼染色体数目

选取清晰的染色体中期分裂相（图1）计数确定染色体众数。在显微镜下对215个中期分裂相进行计数、统计。结果表明，82.79 %的中期分裂相染色体数目为50（表1），据此可确定稀有白甲鱼二倍体染色体众数为50，即2n=50。

2.2 稀有白甲鱼染色体组成

选取30个分散效果良好、着丝粒清晰、长度适中、2条染色单体适度分开的中期分裂相放大、测量、统计。根据Levan等[8]的分类标准统计染色体的相对长度和臂比以及染色体类型，结果见表2。稀有白甲鱼核型公式为2n=50， 12m+16sm+10st+12t，NF=78。染色体对的相对长度范围为（2.84±0.30）%～（4.57±0.56）%。

2.3 稀有白甲鱼核型模式

按Levan等[8]分组排列标准，并依据染色体的相对长度、臂比及染色体形态类型，将稀有白甲鱼50条染色体排列如图2。

从表2、图2可以看出，稀有白甲鱼50条染色体中第1～6号为中着丝粒染色体，第7～14号为亚中着丝粒染色体，第15～19号为亚端着丝粒染色体，第20～25号为端着丝粒染色体。未发现异型染色体、随体染色体和次缢痕。

3 讨论

3.1 鱼类核型研究方法的比较

鱼类染色体标本制备有许多种方法，例如外周血细胞培养或肾细胞PHA短期培养[9-11]、细胞系细胞培养[12]、活体组织和胚胎细胞分裂增殖能力强的器官组织[13-14]。目前，鱼类染色体标本制备多采用头肾-PHA注射法[15]，头肾-PHA注射法具有制备标本快速、方便、易于操作的特点，可获得大量可供分析的中期分裂相细胞。而组织细胞增殖或细胞系细胞培养法对于小型鱼类染色体标本的制作则显示出一定的优越性，特别是越小鱼类或鱼苗[16]，但该方法耗时较长，细胞丢失严重，标本制作质量较差且保存时间短。该试验以稀有白甲鱼头肾为材料，采用腹腔注射PHA-秋水仙素法，制片效果良好。对制好的稀有白甲鱼染色体标本进行仔细对比和观察，未发现异型染色体、随体染色体和次缢痕。

3.2 稀有白甲鱼与白甲鱼属其他鱼类核型特征的比较

迄今，有关文献记载了4种白甲鱼的染色体核型，它们是南方白甲鱼（Onychostoma gerlachi）2n=50，12m+12sm+14st+12t，NF=74[17]；细长白甲鱼（Onychostoma elongatus）2n=50，12m+12sm+14st+12t，NF=74[17]；白甲鱼（Onychostoma simus）2n=50， 10m+16sm+16st+8t，NF=76[2]。在已记载染色体核型的白甲属14个种（亚种）鱼类中（包括本研究在内），约占白甲鱼属28.57%（4/14）。稀有白甲鱼与上述白甲鱼属染色体特征比较见表3。可以看出，白甲鱼属4种鱼的二倍染色体数（2n）均为50；南方白甲鱼和细长白甲鱼的核型相同，稀有白甲鱼、南方白甲鱼、细长白甲鱼的m染色体数目相同；染色体臂数最高则是稀有白甲鱼。上述研究表明，白甲鱼的二倍染色体数目都为50，在自然界中未出现多倍现象。分析白甲鱼属的核型特点，其2n数不变，有差异只是染色体臂数NF不同。染色体臂数的不同，说明了其在进化程度的差异。导致这一差异的原因可能是其自身遗传因子所决定，也可能是其分布地理差异引起的[18]。

3.3 稀有白甲鱼的进化地位

稀有白甲鱼隶属于鲤形目鲤科鲃亚科，根据余先觉等[19]认为鲃亚科染色体的基本二倍体数为2n=50，该研究中稀有白甲鱼染色体基本二倍体数目均与之相符。而鲃亚科的另一些种、属2n数为96～100，被认为是多倍体类型[20-21]，对此昝瑞光等[22]曾做过阐述。鲤科鲃亚科鱼类其染色体数目的进化是十分保守的，而其染色体臂数逐渐增加是这些鱼类核型进化的一个主要趋势[23]。因此，究其稀有白甲鱼染色体数目，其进化也是比较保守的，而其染色体臂数与其他白甲鱼染色体臂数相比，则有相对的进化。李树深[24]认为，在特定的分类群中，具有较多端部着丝粒染色体的种类为原始类群，而具有较多中部或亚中部着丝粒染色体的是特化类群，即染色体臂数多的类群比染色体臂数少的类群更为特化。表3所列的4种白甲鱼进化程度南方白甲鱼、细长白甲鱼、白甲鱼稀有白甲鱼的顺序递增。鱼类细胞系在一个成熟的细胞系中会发生成千上万的染色体变异，这些变异受来自于自然发生的变异或受环境条件影响发生的变异而不影响到细胞系的存活[25]。白甲鱼属种间这种染色体特征的变异差异，显然是受自身遗传变异和不同地理差异引起的。而王世峰[26]则指出进化程度变高原因可能是染色体结构的进化是原始核型经染色体易位、倒位等染色体重组进化形成的。因此，西江种群稀有白甲鱼是较为原始的类群，但是比其他几种白甲鱼属的鱼类进化程度相对较高。

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