大鼠脑出血模型脑组织NgR的表达形式

摘要：目的观察大鼠脑出血后不同时间点脑组织NgR(Nogo-66 Receptor )的表达情况。方法大鼠断尾取血100 μL，分3次注入大脑尾状核,分别于手术后6 h、24 h、48 h、72 h和7 d处死动物。采用免疫组织化学方法检测脑组织NgR的表达变化。结果与假手术组相比较，脑出血后6 h，NgR表达增高(P<0.01)，72 h达到高峰(P<0.01)，7 d后降低但仍然高于假手术组(P<0.01)。结论NgR的上调是脑出血的重要特征之一，并且在脑组织的病理损害过程中起着重要作用。

关键词：脑出血 NgR 免疫组织化学 轴突再生

中图分类号：R743.3R285.5文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0579-02

哺乳动物中枢神经系统损伤后，受损神经元轴突再生非常有限。已有实验证实轴突生长抑制蛋白髓鞘相关糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG)、Nogo-A和少突胶质细胞/髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp ) 可以通过其共同受体NgR-66受体（NgR)介导信号传导，造成生长锥塌陷，对轴突再生产生抑制作用^［1］。因此，可以对NgR进行干预以促进中枢神经系统轴突再生^［2］。但近年来，关于中枢神经系统中NgR的研究主要集中于脊髓外伤^［3］、视神经损伤^［4］、脑梗死等^［5］。但是脑出血后脑组织NgR的表达情况，特别是时间依赖性的表达研究报道仍然缺乏。

脑出血占所有卒中的10%～15%，动物实验提示最初的机械性损害及占位效应，血块源性的因素是造成脑出血脑损伤中重要的因素^［6］。目前缺乏有效的药物和治疗措施来减轻损伤和促进轴突再生以改善神经功能。本实验旨在研究脑出血后脑组织NgR时间依赖性的变化及表达规律，为脑出血治疗提供新的时间窗，提高脑出血后的神经功能恢复。

1材料与方法

1.1动物与分组Wistar大鼠由山西医科大学动物实验中心提供，活动灵活的200 g~250 g成年大鼠，分为6组。假手术组及5个脑出血组（6 h,24 h,48 h，72 h及7d）。脑出血组大鼠分别于出血后6 h，24 h，48 h，72 h及7 d处死。假手术组大鼠在脑出血6 h后处死。

1.2脑出血模型采用自体血三次注血法建立^［7］。采用微量注射器从颅骨预先钻好的小孔（中线旁开2 mm,前囟前1 mm,深度5.5 mm）注入。首先注入20 μL，停留10 min后，40 μL血在2 min内缓慢注入，最后40 μL的血以同样的方式注入，停留10 min。假手术组造模方法类似，扎针不注射血。

1.3免疫组织化学染色断头取脑后，将脑组织置于4 ℃ 的4%多聚甲醛中浸泡8 h~12 h，后经过石蜡包埋。制作5μm切片进行HE染色和免疫组织化学染色，采用亲和生物素法的试剂盒。阳性对照：随机抽取多个样本重复证实标志物的存在。阴性对照:采用非免疫的血清代替一抗进行实验。采用BI-2000医学图像系统分析NgR表达情况，每张切片随机选取10个视野进行OD值的测定。免组织化的程度通过OD值进行半定量分析。

2结果

2.1HE 染色对照组脑组织正常，组织形态正常，细胞结构完整。脑出血6 h有少量的坏死神经元和散在炎性细胞浸润,炎症细胞浸润在脑出血后24 h逐渐上升，72 h达到高峰，并在血肿周围出现胶质细胞和毛细血管增生。在脑出血7 d时，血肿明显减轻，血肿周围出现明显胶质和毛细血管增生。

2.2脑皮质NgR免疫组织学观察脑出血6 h血肿周围开始出现少量的NgR阳性细胞。阳性表达高于对照组，平均光密度值高于对照组（P<0.01)。之后随着时间的延长，NgR表达在脑出血后 24 h，48 h，72 h逐渐增多，但在7 d时有所降低，但仍高于 6 h，24 h 及假手术组。同时，光密度值也在脑出血后24 h逐渐增高(P<0.01)，72 h到达高峰(P<0.01），与对照组相比，7 d降低。详见图1。

图1脑皮质NgR表达平均光密度值

3讨论

本实验发现，大鼠脑组织NgR的表达在脑出血后12 h,24 h,48 h,72 h呈时间依赖性上调。脑组织NgR的表达形式与脑组织急性期损伤程度变化相一致。 在实验动物脑出血模型中，脑出血周围组织在没有出现脱髓鞘的情况下，出现了轴突损害^［8］。在本实验中，NgR作为中枢神经系统受损后抑制轴突再生的重要因素，在手术后72 h表达最高。说明NgR可能在脑出血早期参与了轴突损害过程。脑出血后NgR表达形式局灶性脑梗死脑组织NgR的表达情况不同，这可能与脑出血后凝血级联以及红细胞破裂后的产物有关^［6］。

NgR的发现以及其在中枢神经系统突起再生中的抑制性作用促使人们对其进行了大量的研究。近些年，人们试图通过多种方法从基因水平,蛋白水平对NgR干预以促进轴突的再生。在离体及在体实验中均发现应用抗NgR的DNA疫苗可以明显促进脊髓损伤后的轴突再生^［9］。 通过皮下注射NgR拮抗肽NEP1-40促进脊髓损伤患者轴突的重塑^［10］。侧脑室给予NgR受体拮抗剂，可以明显提高小鼠脑梗死模型轴突的可塑性，从而促进神经功能恢复^［11］。这些研究在进一步证实NgR作用的同时为中枢神经系统损害治疗提供了新的治疗措施。但是新的治疗方法需要不断完善以治疗脑出血后神经功能的恶化。本实验发现脑出血后12 h NgR在脑白质表达逐渐上调，在72 h达到高峰，7 d时开下降。此研究结果将为采用NgR抗体治疗脑出血促进神经功能恢复提供切实有效的时间窗。

参考文献:

［1］Li MF，Shi TH，Wei Z,et al.Structural characterization of the human Nogo-A functional domains.Solution structure of Nogo-40，a Nogo-66 receptor antagonist enhancing injured spinal cord regeneration［Ｊ］.Eur J Biochemistry，2004,271(17):3512-22.

［2］Lee DH，Strittmatter SM，Sah DW，et al.Targeting the Nogo receptor to treat central nervous system injuries［Ｊ］.Nature Review Drug Discovery，2003,2(11):872-878.

［3］Josephson A，Trifunovski A，Olson L，et al.Nogo-receptor gene activity:Cellular localization and developmental regulation of mRNA in mice and humans［Ｊ］.J Comparative Neurology，2002，453(3):292-304.

［4］Ellezam B，Bertrand J，Dergham P,et al.Vaccination stimulates retinal ganglion cell regeneration in the adult optic nerve［Ｊ］.NeurobiologyDisease，2003，12(1):1-10.

［5］Wen J，Feng X，Junliang H,et al.Patterns of Nogo-A，NgR，and RhoA expression in the brain tissues of rats with focal cerebral infarction［Ｊ］.Translation Reserch，2009，154(1):40-48.

［6］Keep RF，Hoff JT.Mechanisms of brain injury after intracerebral haemorrhage［Ｊ］.Lancet Neurology，2006，5(1):53-63.

［7］李红玲,刘瑞春,缑元冲,等.自体血三次注入法建立脑出血大鼠模型究［J］.中国康复理论与实践,2006,8(12):651-653.

［8］Jason K，Wasserman,Lyanne C,et al.White matter injury in young and aged rats after intracerebral hemorrhage［Ｊ］.Exprimental Neurology，2008，214(2):266-275.

［9］Panpan Y，Lidong H，Jian Z,et al.DNA vaccine against NgR promotes functional recovery after spinal cord injury in adult rats［Ｊ］.Brain Research，2007，1147:66-76.

［10］Li S，Strittmatter SM.Delayed systemic Nogo-66 receptor antagonist promotes recovery from spinal cord injury［Ｊ］.Neuroscience，2003，23(10):4219-4227.

［11］Lee JK,Kim JE,Sivual M,et al.Nogo receptor antagonism promotes stroke recovery by enhancing axonal plasticity［Ｊ］.Neuroscience，2004,24(27):6209-6217.

作者简介:贾晓涛(1985—),男,现为山西医科大学第二医院神经内科2008 级在读硕士研究生（邮编:030001)；李东芳（通讯作者)，工作于山西医科大学第二医院（邮编:030001)；罗岗、刘正姣，为山西医科大学第二医院神经内科2008 级硕士研究生；潘艳芳，现为协和医科大学2010级生物化学与分子生物学专业博士研究生。

（收稿日期:2010-11-16）

(本文编辑王雅洁）