抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达策略

摘要：抗菌肽抗菌谱广、活性稳定，具有与抗生素不同的抗菌机制，在抑杀病原微生物的同时不易产生耐药性，在免疫调节和抗感染方面具有巨大的发展潜力，能够发展为取代抗生素的新型药剂，在食品、饲料、畜禽养殖等领域也具有重要的应用价值。基因工程技术是降低抗菌肽生产成本的主要方式，其中融合表达在提高抗菌肽产量方面起到了重要作用。综述了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的国内外研究进展，探讨了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的策略，并对高通量融合表达抗菌肽提出了建议。

关键词：抗菌肽；大肠杆菌；基因工程；融合表达；高通量

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）15-2801-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.001

Abstract： Antimicrobial peptides have a wide antimicrobial spectrum and stable activity， with different antibacterial mechanisms from antibiotics， they result in a higher efficacy against pathogens. At the same time， they"re difficult to form drug resistance. Antimicrobial peptides have great development potential in immune regulation and anti-infection， so they"re able to develop new agents， to replace antibiotics. Besides， they have immense applied value in food， forage， poultry breeding and so on. Genetic engineering is the main way to reduce the production costs in antimicrobial peptides， furthermore， the fusion expression plays a important role in improving production. In this paper， we summarized the research progress of antimicrobial peptides" fusion expression in E. coli， at home and abroad. Also， the fusion strategy in E. coli are discussed， and we proposed our own view on the high flux fusion expression of antimicrobial peptides.

Key words： antimicrobial peptides； Escherichia coli； genetic engineering； fusion expression； high-throughput

真菌、细菌对抗生素的耐药性引起了全世界范围的普遍担忧，导致巨大的财力、物力花费在寻找新型抗生素上，但效果甚微[1]。一些抗生素对普通的感染作用效果差，引起大众对不可治愈的恐慌[2]。现在大量的研究者从事于抗生素的耐药性机理的研究，但是由于缺乏协调行动，进展非常缓慢[3]。目前的形势需要开发出抗生素的替代品。

抗菌肽是动物、植物等生物体免疫系统防御外来真菌、细菌等病原微生物入侵而合成的一类小分子多肽类物质[4，5]。抗菌肽一般由10～60个氨基酸组成，其中接近一半是亲水性氨基酸，带有一定量的正电荷，能够直接攻击或破坏细菌、真菌的细胞膜或病毒的包膜。不同于抗生素作用于酶或DNA，抗菌肽能够阻碍产生耐藥性，并且对热稳定，一些抗菌肽100 ℃加热10 min仍有活性，有较宽的pH耐受范围[6]。加热抗菌肽抗菌谱广，活性稳定，并且不会对人及其所生存的环境产生危害，绿色环保。基于这些优点，激发了广大科研人员的兴趣，科研人员已经对抗菌肽的作用机制、安全性进行了深入研究，并且提供了抗菌肽在线更新数据库（APD，http：//aps.unmc.edu/AP/）服务[6，7]。已经有2 000多种抗菌肽被分离出来[8]，其中，部分已经用于医药、食品及畜禽水产养殖等领域[9]。

尽管在抗菌肽的研究领域已经取得丰硕的成果，但由于生产成本居高不下，难以投入工业化生产和商业化运营。大量高纯度的抗菌肽是开展基础研究及临床实验的关键。天然来源的抗菌肽资源有限、纯化困难，化学合成抗菌肽成本高、活性不稳定，因此通过基因重组来表达得到大量抗菌肽是低成本、高效益的方法[10]。

1 抗菌肽表达系统

1.1 昆虫表达系统

广泛使用的真核表达系统，赵昆等[11]实现牛抗菌肽Bac7-Bac5-β defense串联基因在昆虫杆状病毒系统中的表达。昆虫具有一般真核生物翻译后修饰的功能，且表达水平高，成本低，但是翻译后加工修饰操作繁琐。

1.2 毕赤酵母表达系统

另一个常用的真核表达系统为毕赤酵母。同昆虫一样具有完备的翻译后修饰的功能，目前已经实现了多种抗菌肽在其中的表达，如孙立人等[12]试验斑点叉尾鮰LEAP-2抗菌肽在毕赤酵母中的表达，随着发酵时间的延长，表达产量在上升，当发酵培养120 h后产量达到2.7 mg/L（最高值）。Farzana等[13]利用pPIC9K表达载体实现了人类抗菌肽hpcidin在毕赤酵母中的分泌表达及纯化和功能验证，并且表达量稳定在3 mg/L。毕赤酵母中存在表达水平低，发酵周期长，易污染等问题[14]。