CO2浓度对嗜碱绿球藻MC—1光合作用和生长的影响
摘要：为了实现微藻的烟气培养，从而降低培养成本，达到减排目的，以1株嗜碱绿球藻Chlorococcum alkaliphilus MC-1为研究材料，检测不同浓度CO2（5%、15%、50%、100%）对该藻光合放氧速率和生长的影响。结果显示，CO2浓度为5% 时，该藻光合放氧速率最大，平均值为117.60 μmol/（h·mg）（以单位时间、单位质量叶绿素的放氧量计），生长状态也最好，平均生物量产率、平均比生长速率、平均CO2固定速率均最大，分别为（0.063±0.001）g/（L·d）、（0.201±0.001） d-1、（0.188±0.002）g/（L·d），最高生物量浓度为（0.778±0.006）g/L。当CO2≥15%时，该藻光合作用和生长虽受到一定程度抑制，但当CO2浓度达到100%时，该藻光合放氧和生长状态依然保持较高水平，平均光合放氧速率为100.38 μmol/（h·mg），平均生物量产率、平均比生长速率、平均CO2固定速率分别为（0.048±0.002）g/（L·d）、（0.179±0.002） d-1、（0.090±0.004）g/（L·d），最高生物量浓度为（0.613±0.017）g/L。以上结果表明，该藻对高浓度CO2具有较强的耐受性，是1株极具潜力的烟气减排藻种。
关键词：微藻；烟气；减排；CO2；光合放氧速率
中图分类号： Q935 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0158-04
收稿日期：2017-03-04
基金项目：国家海洋局南海分局海洋科学技术局长基金（编号：1514）；广东省自然科学基金（编号：2014A030310495）。
作者简介：杨熙（1989—），男，湖北荆州人，硕士，助理工程师，主要从事能源微藻的筛选和培养、海洋浮游生物鉴定方面的研究。E-mail：yang1209xi@163.com。
通信作者：向文洲，博士，博士生导师，主要从事海藻生理生化、海藻天然产物、保健食品及可再生资源的开发利用研究。Tel：（020）89023223；E-mail：xwz@scsio.ac.cn。 由于温室气体的大量排放所引起的温室效应已经成为全球关注的热点问题，减排形势也越来越严峻，其中，CO2是主要的温室气体[1]。微藻可通过光合作用将CO2固定转化为有机物，从而达到减排目的，由于微藻具有生长速率快、生长周期短、固碳效率高、产量高等特点，利用微藻进行减排已成为目前研究的热点[2]。
一些工厂由于燃烧煤炭所排放出的烟气中含有大量CO2，而微藻培养中碳源成本占总培养成本的41%[3]，如果利用这些烟气作为碳源来培养微藻，则不但生产所需的碳源成本可忽略不计，而且能达到减排的目的，可谓一举两得。煤炭烟气中CO2浓度（体积分数）一般在15%～20%，而CO2浓度是影响微藻光合作用和生长的一个重要因素[4]。关于微藻对CO2浓度适应性的研究已多见报道，如Kaplan等发现微藻Anabaena variabilis在低浓度CO2（0.03% CO2）下光合放氧速率很快达到最大值，而在高浓度CO2（5% CO2）下其光合放氧速率受到明显抑制[5]；郭祯等比较了不同CO2浓度（1%、3%、5%、10%、15%）对亚心形扁藻生长的影响，发现3% CO2对该藻生长最有利，当CO2浓度大于3%时，该藻光合作用和生长受到抑制[6]；Chiu等利用空气与2%、5%、10%、15% CO2培养1株小球藻，发现该藻最适CO2浓度为2%，当CO2浓度为5%时，藻的生长受到明显抑制，CO2浓度为10%、15%时，藻的生长完全被抑制，甚至出现藻细胞死亡现象[7]。目前所报道的大部分微藻对CO2的耐受度较低，不能适应含有高浓度CO2的烟气培养条件，因此，寻找适应性强、易于培养且能耐受高浓度CO2的藻种是实现微藻烟气培养的关键。
笔者所在实验室发现1株极具潜力的减排藻种——嗜碱绿球藻Chlorococcum alkaliphilus MC-1，该藻种具有适应性强、生长速度快和pH值快速漂移等特性，易于在室外大规模培养[8-9]。但是CO2浓度对其光合作用和生长的影响尚不明确。因此，本研究以该藻为试验材料，通过测定不同浓度CO2对该藻光合放氧速率、生长状态的影响，以期为实现该藻的煙气培养和培养条件的优化提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 藻种和培养基
本研究采用1株嗜碱绿球藻Chlorococcum alkaliphilus MC-1 （暂定名，简称MC-1） 作为试验藻种，该藻种由中国科学院南海海洋研究所微藻项目组于2002年在室外蓝藻培养箱中分离并经过固体纯化培养后获得[8]。
本试验中所用培养基配方在原ZSNT培养基[8]的基础上加以调整，调整后的配方见表1。M2溶液：1 L蒸馏水中添加0.24 g FeCl3·6H2O、0.19 g Na2-EDTA。A5溶液：1 L蒸馏水中添加2.86 g H3BO3、1.81 g MnCl2·4H2O、0.22 g ZnSO4·7H2O、0.08 g CuSO4·5H2O、0.02 g Na2MoO4、1滴浓H2SO4。B6溶液：1 L蒸馏水中添加22.96 mg NH4VO3、19.90 mg K2CrO4、47.85 mg NiSO4·6H2O、17.91 mg NaWO4·2H2O、40.00 mg Ti（SO4）3、43.98 mg Co（NO3）2·6H2O。
1.2 光合放氧速率的测定
1.2.1 不同浓度CO2补充下光合放氧速率的测定 先将处于生长期的微藻用MC-1培养基配制成浓度约为25 μg/mL（以单位体积的叶绿素质量计）的藻液，并在光照度为 135.14 μmol/（m2·s）、温度为25 ℃的条件下光照培养至其pH值升至10.50。试验分4组（CO2含量分别为5%、15%、50%、100%）进行，每组分别通入对应浓度的CO2，将藻液的pH值依次降为9.50、9.00、8.50、8.00、7.50、7.00、6.50。利用Hansatech公司的Oxygraph氧电极测定每个pH值下的光合放氧速率（以单位时间、单位质量叶绿素的放氧量计），测定时的光照度为135.14 μmol/（m2·s），光源为冷白炽光，反应杯的温度通过恒温控制仪维持在25 ℃，在反应杯中加入 2 mL 藻液，每次测定8 min。
1.2.2 不同pH值下光合放氧速率的测定 将处于对数生长期的微藻利用MC-1培养基配制成浓度约为 25 μg/mL 的藻液，然后利用HCl、NaOH将藻液pH值分别调为2.0、30、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，每组设3个平行。每次调完pH值后，间隔30 min，然后利用氧电极测定光合放氧速率（以单位时间、单位质量叶绿素的放氧量计）。反应杯中加入2 mL藻液，通过恒温控制仪维持反应杯温度在25 ℃，测定时的光照度为135.14 μmol/（m2·s），光源为冷白炽光，每次测定8 min。
1.3 不同浓度CO2培养试验的培养条件
本试验于室内进行，培养容器为1 L三角瓶，藻液体积为700 mL，起始D700 nm为0.312，以白炽灯为光源，光照度为13514 μmol/（m2·s），光—暗周期为12 h—12 h，培养温度为25 ℃。试验分4组进行（CO2浓度分别为5%、15%、50%、100%），每个试验组设3个平行。每天摇瓶3～4次，连续培养11 d，每天10：00测定pH值和干质量。其中pH值用FiveGo基础型便携式pH计-FG2-FK（METTLER TOLEDO，美国）直接测定；干质量的测定方法：取15 mL藻液，用 0.22 μm 微孔滤膜过滤并用去离子水清洗2次，于110 ℃下烘干至恒质量后测定。
1.4 气源和补气方式
气源采用CO2、N2以不同浓度比混合的气罐，CO2体积分数分别设为5%、15%、50%、100%。采用间歇性补气方式培养，由于该藻在培养时会产生明显的pH值漂移现象，即藻液pH值会在短时间内快速上升[9]，当pH值升至10.0时，开始补充CO2气体，通气速率为150 mL/min，当pH值降到700时停止供气，如此反复，此补气过程均采用人工控制，夜间停止补气。
1.5 生长指标计算
式中：P為生物量产率，g/（L·d）；C为藻体中碳元素质量分数；MCO2、MC分别为CO2、C的相对分子质量。
1.6 统计分析
采用SPSS 10.0对试验结果进行方差分析，数据以“平均值±标准差”来表示，用Origin 8.0进行数据处理和作图。
2 结果与分析
2.1 不同浓度CO2连续补充下微藻MC-1光合放氧速率的变化
通过连续补充不同浓度CO2气体，将各试验组藻液pH值从起始的10.50依次降为9.50、9.00、8.50、8.00、7.50、700、6.50，并测定各pH值下微藻的光合放氧速率。由图1可见，开始补充CO2气体后，各试验组光合放氧速率均开始回升，pH值从10.50降至8.50这一过程中光合放氧速率上升幅度最大；pH值从8.50减至7.00时，各试验组的光合放氧速率增幅变缓，处于相对平稳的状态；当pH值从7.00降至6.50时，5%、15%、50% CO2组的光合放氧速率都有所增加，而100% CO2组则表现出下降趋势。在整个过程中，虽然各试验组光合放氧速率的变化趋势大体相似，但各试验组的平均光合放氧速率的大小有显著差异
2.2 不同浓度CO2培养试验
2.2.1 微藻MC-1光合作用的pH值适应特性 通过测定不同pH值下微藻MC-1的光合放氧速率来检测该藻的pH值适应特性，以便为后面进行不同浓度CO2培养试验中pH值条件的确定提供参考。由图2可见，藻液pH值在6.0～90之间时，该藻的光合放氧速率处于相对较高值，当pH值为7.0时光合放氧速率达最大值，为138.42 μmol/（h·mg）。虽然pH值﹤5.0或pH值﹥10.0时微藻MC-1的光合放氧作用受到一定抑制，但即使pH值低至2.0或高达110时，该藻依然保持着一定的光合作用效率，而没有完全被抑制。上述结果表明，该藻的最佳生长pH值区间为6.0～9.0，最适生长pH值为7.0，且对强酸性、强碱性条件有较强的耐受能力。
2.2.2 不同浓度CO2培养下微藻MC-1生长状态的变化 为了验证微藻MC-1对CO2浓度的耐受性，本试验测定了不同浓度CO2培养下微藻MC-1生长状况的变化。通过参考微藻MC-1的pH值特性，培养过程中采用间歇性补气方式，藻液pH值控制在7.00附近。经过11 d的连续培养发现，不同浓度CO2对微藻MC-1生长有显著影响（P
3 讨论
3.1 不同浓度CO2连续补充对微藻MC-1光合作用的影响
本研究通过分别导入不同浓度CO2气体，使藻液pH值从初始的10.50降至6.50，并测定这一过程中微藻光合放氧速率的变化，以此来模拟平常试验中利用CO2气体对微藻进行间歇性补气以补充碳源的过程。微藻在不同浓度CO2培养下可表现出不同的光合作用特性，Kaplan等研究不同浓度CO2对微藻Anabaena variabilis光合放氧速率的影响发现，003% CO2浓度下光合放氧速率很快达到最大值，而在5%CO2浓度下其光合放氧速率随着培养时间增加缓慢上升，但总体上受到明显抑制[5]。Satoh等将空气条件下培养的微藻Chlorococcum littorale转入高浓度CO2条件下（40% CO2），发现其光合作用受到强烈抑制[10]，其原因与高浓度CO2导致细胞内酸化，从而造成光合作用相关酶失活有关。
CO2浓度是影响微藻光合作用的重要因素，当向藻液中补充CO2气体时，藻液中分子态CO2开始增加，分子态CO2可被微藻直接吸收利用而不需要消耗过多能量，适当增加所补充的CO2浓度可以使藻液中可被直接利用的分子态CO2浓度增加，从而使光合效率提高。而当所补充的CO2浓度过高时（CO2≥15%），会造成CO2向细胞质内扩散增加，并水解产生HCO3-、H+，造成细胞内pH值下降，这种酸化会抑制细胞内碳酸酐酶的活性，并对细胞质造成毒性作用，阻碍微藻对CO2的进一步吸收和利用[11]，从而降低光合作用水平。本研究显示，不同浓度CO2对MC-1光合放氧速率有显著影响，5% CO2组的光合放氧速率最大，CO2浓度为15%～100%时光合作用会受到一定程度抑制，但抑制作用并不大，其光合放氧速率仍处于较高水平，说明该藻对高浓度CO2具有较强的耐受性。
此外，在补充CO2降pH值这一过程中，各试验组光合放氧速率会随pH值的变化而呈现出具有一定规律的变化趋势，产生此现象的原因与该藻对无机碳的利用机制有关[12-13]。碳源是微藻生长所必需的大量元素，它在溶液中以CO2、HCO3-、CO32-等无机碳形态存在，这3种形式无机碳的比例随着溶液中pH值的变化而改变，因此，微藻在不同pH值下所能利用的无机碳形态也不同。当pH值≤6.0时，溶液中的无机碳主要以CO2的形式存在，水体中分子态CO2可被微藻直接吸收利用而不需要消耗过多能量；当6.0
3.2 不同浓度CO2连续补充对微藻MC-1生长的影响
关于不同浓度CO2对微藻生长影响的研究报道已非常多见，如Mudimu等分别利用空气、5% CO2、15% CO2气体来培养3种微藻Coccomyxa sp.、Desmodesmus sp.、Muriella terrestris[16]，发现用空气、15% CO2培养的条件下，藻的生长状态非常相似，但5% CO2培养下3种微藻的生长状态均明显好于空气、15% CO2组；Razzak等设置2%、4%、6%、8%、10%、12%的CO2浓度梯度来培养微藻Nannochloropsis oculata，结果显示8% CO2浓度下微藻的生长状态最好，最高产量达0.088 g/（L·d）[17]；郭祯等在鼓泡式光生物反应器中比较了不同CO2浓度（1%、3%、5%、10%、15%）对亚心形扁藻生长的影响，发现3% CO2对该藻生长最有利[6]。本试验利用不同浓度CO2培养微藻MC-1，发现5% CO2组藻的生长状况最好，虽然高浓度CO2（15%～100%）下藻的生长受到了一定程度的抑制，但依然保持较好的生长状态，这种结果与不同浓度CO2对微藻MC-1光合放氧作用影响的结果形成了很好的对应关系。这是由于不同浓度CO2对微藻生长的影响首先体现在对藻光合作用的影响上，当光合作用增强，则微藻生长受到促进，反之，当光合作用减弱，则微藻生长受到抑制。该试验结果进一步证明微藻MC-1在5% CO2下具有较好的生长状态，同时也能适应高浓度CO2（15%～100%）的培养条件，对高浓度CO2的耐受性较强。
3.3 微藻MC-1烟气培养方法的优化
笔者所在实验室此前的研究已验证微藻 MC-1能适应真实烟气的培养条件[18]，但培养方法较粗略，需要进行优化。本试验检测了不同浓度CO2对微藻MC-1生长和光合作用的影响，发现该藻对高浓度CO2（15%～100%）的耐受性较强，但在5% CO2培养下生长状态最佳。而煤炭烟气中CO2浓度一般为15%～20%，因此在实施该藻的烟气培养时可以利用混入空气的方法将烟气中CO2浓度稀释为5%，这样既有利于微藻的生长，又不影响烟气的吸收处理。通过对该藻pH值特性的检测，发现该藻在pH值为70时光合放氧速率最大，其最佳生长pH值区间为6.0～90，较嗜好中性偏碱性环境，且该藻具有pH值快速漂移特性，即藻液pH值可在短时间内快速上升，因此可以采用间歇性补气的方式来培养该藻，即当藻液pH值升至10.0时，开始补充CO2气体，当pH值降到7.0时停止供气，如此反复，这样可以避免连续通气造成的藻液pH值过低，以及烟气的过多逃逸，有利于烟气更充分有效地被吸收利用。
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