酿酒酵母的乳酸抗性机制

摘要：以酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）乳酸抗性单倍体突变株Ｔ－２７－２４（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－）和其亲株Ｔ－２７（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－）为研究对象，考察于３０℃在５％（Ｖ／Ｖ，下同）乳酸冲击条件下菌体存活率、细胞膜通透性以及菌体积累海藻糖和麦角固醇等方面的情况。结果表明，在５％乳酸冲击下，Ｔ－２７－２４菌体存活率明显高于Ｔ－２７，且比Ｔ－２７具有较强的降低细胞受冲击时细胞膜通透性的作用；同时Ｔ－２７－２４对海藻糖和麦角固醇的积累能力都明显高于Ｔ－２７。因此，Ｔ－２７－２４具有较强的维持细胞膜完整性和积累海藻糖及麦角固醇的能力，这是其具有乳酸抗性的重要原因。

关键词：酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；乳酸抗性；细胞膜通透性

中图分类号：ＴＱ９２６．１；Ｑ９３５ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）02－0367-02

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ

ＣＨＥＮＧ Ｓｈｕ－ｍｅｉ１，２，ＬＩ Ｈｕｉ－ｙｉｎｇ２，ＧＵ Ｊｉｎ－ｌａｎ１，ＷＡＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｌｕ１

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｑｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００0２２，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１０００，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ａ ｈａｐｌｏｉｄ ｍｕｔａｎｔ Ｔ－２７－２４（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－） ａｎｄ Ｔ－２７（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－） ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈａｌｌｉ， ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ tｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｎｄ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ５％（Ｖ／Ｖ） ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ａｔ ３０℃． Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ Ｔ－２７－２４ ｔｈａｌｌｉ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌular membrane ｔｈａｎ Ｔ－２７； Aｌｓｏ Ｔ－２７－２４ ｃｏｕｌｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｍｏｒｅ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｎｄ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ ｔｈａｎ Ｔ－２７． Ｉｎ ａ ｗｏｒｄ， ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｎｄ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ａ ｌｏｔ ｔｏ ｔｈｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｔ－２７－２４．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ； ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ； ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌular membrane

酵母菌是一种单细胞低等真核生物，是人类应用最早的微生物，特别是酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）的工业应用比较广泛。目前对酿酒酵母耐酒精［１］、耐渗透压机理的研究已经比较深入，但对于酿酒酵母抗酸的机理研究，特别是抗性与其细胞膜的完整性以及细胞在恶劣环境中对一些特殊物质的积累（例如海藻糖和麦角固醇）之间的关系的研究尚未见报道。

在利用酵母菌的发酵工业中，大多数采用纯种进行发酵，通常采用嗜杀酵母或添加有机酸的方法来抑制杂菌［２］。因此将抗酸酵母应用于酸度较高的葡萄汁中进行葡萄酒发酵等具有重要意义。

通过研究酿酒酵母乳酸抗性产生与细胞膜通透性及海藻糖和麦角固醇积累能力的关系，对完善酵母乳酸抗性机理具有重要意义。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 菌种 Ｔ－２７（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－）由天津科技大学食品生物技术研究室保藏。Ｔ－２７－２４（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－）是由Ｔ－２７诱变得到的乳酸抗性酵母单倍体突变株。

１．１．２ 培养基 ＹＰＤ培养基：酵母膏１ g/L，蛋白胨２ g/L，葡萄糖２ g/L，ｐＨ ６．０。培养基灭菌条件为１２１ ℃灭菌２０ ｍｉｎ。

１．２ 方法

１．２．１ 高浓度乳酸冲击下菌体存活率的测定方法 为研究高浓度乳酸冲击下菌体的生长情况，将在１００ ｍＬ ＹＰＤ培养基中培养到对数生长期的Ｔ－２７及Ｔ－２７－２４发酵液进行离心、洗涤、收集菌体，转移至１００ ｍＬ ５％（Ｖ／Ｖ，下同）乳酸溶液中，摇床条件下（２２０ ｒ／ｍｉｎ）进行冲击，定期取样，按照稀释平板法做活菌记数，计算菌体存活率。

１．２．２ 细胞膜通透性的测定方法 由于细胞膜上没有运载核苷酸的载体，因此可以通过测定胞外核苷酸浓度研究细胞膜的通透性［３］。将在１００ ｍＬ ＹＰＤ培养基中培养至对数生长期的Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４发酵液进行离心，去离子水洗涤，直至上清液在２６０ ｎｍ处的光吸收可以忽略为止，将菌体转移至１００ ｍＬ ５％乳酸溶液中，３０ ℃进行摇床培养。定期检测溶液在２６０、２８０ ｎｍ处的吸光度，直至两者都达到平衡值。胞外核苷酸浓度＝１１．８７×Ａ２６０ ｎｍ-１０．４０×Ａ２８０ ｎｍ，核苷酸浓度以每毫升溶液含磷的微克数来表示。

１．２．３ 细胞海藻糖和麦角固醇含量的测定方法 海藻糖含量测定参考文献［４］方法进行，麦角固醇含量测定参考文献［５］方法进行。

２ 结果与分析

２．１ 高浓度乳酸冲击下菌体存活率的测定结果

Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４于３０℃在５％乳酸溶液中进行冲击，其菌体存活率如图１所示。由图１可知，在5%乳酸冲击９０ ｈ时Ｔ－２７的存活率为０，而Ｔ－２７－２４的存活率为４６％，表明乳酸抗性单倍体突变株Ｔ－２７－２４对5%乳酸的抵抗力明显高于出发菌株Ｔ－２７。为进一步探讨突变株对5%乳酸的抗性与细胞膜特性的相关性，进一步对Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４的细胞膜通透性进行研究。

２．２ 细胞膜通透性的测定结果

Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４于３０℃在５％乳酸冲击下胞外核苷酸浓度的变化如图２所示。图２显示了Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４在５％乳酸冲击下胞内核苷酸通过细胞膜的扩散进程，从图２中可以看出，乳酸抗性单倍体突变株Ｔ－２７－２４与其出发菌株Ｔ－２７相比，在相同冲击时间内胞内核苷酸的扩散进程明显降低，证明在５％乳酸冲击下，乳酸抗性单倍体突变株Ｔ－２７－２４具有较强的降低菌体受冲击时细胞膜通透性的作用，即具有较强的增强膜渗透屏障的能力。

２．３ 细胞海藻糖和麦角固醇含量的测定结果

鉴于海藻糖和麦角固醇在维持细胞膜的稳定性方面都具有重要作用［１］，为验证其是否在酿酒酵母对乳酸抗性中具有作用，对Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４在５％乳酸冲击条件下进行检测，结果分别如图３和图４所示。从图３和图４可以看出，于３０℃在５％乳酸冲击条件下，乳酸抗性单倍体突变株Ｔ－２７－２４的海藻糖和麦角固醇的含量都明显高于其出发菌株Ｔ－２７。由此可见，乳酸抗性单倍体突变株Ｔ－２７－２４在积累海藻糖和麦角固醇方面具有明显的优势，其在保持菌株于恶劣环境中维持细胞膜的完整性方面具有重要作用。

３ 讨论

目前，已知海藻糖、麦角固醇在恶劣条件下具有保持蛋白质、核酸等大分子物质的结构和功能不受破坏的特异功效，但对菌体在恶劣条件下对细胞膜通透性的影响还未见报道。以上研究证明，乳酸抗性单倍体突变株Ｔ－２７－２４在维持细胞膜的完整性和积累海藻糖、麦角固醇方面具有较强能力，这是其对乳酸抗性的重要原因。

参考文献：

［１］ 池振明，高 峻． 酵母菌耐酒精机制的研究进展［Ｊ］． 微生物学通报，１９９９，２６（５）：３７３－３７６．

［２］ 王昌禄，杜连祥，顾晓波，等． 抗酸酵母遗传特性的初步研究［Ｊ］． 微生物学通报，１９９８，２５（４）：２１３－２１７．

［３］ ＭＩＺＯＧＵＣＨＩ Ｈ，ＨＡＲＡ Ｓ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒｓ ｏｎ ｓｉｍｐｌｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ａｔ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９６，８１（５）：４０６－４１１．

［４］ 张 岩，梁 盟，刘德华． 克鲁氏假丝酵母在高渗环境中海藻糖和胞内甘油积累的研究［Ｊ］． 生物工程学报，２００１，１７（３）：３３３－３３４．

［５］ 张博润，何秀萍，铁翠娟，等． 麦角固醇高产菌株的构建及其培养优化条件的研究［Ｊ］． 生物工程学报，１９９９，１５（１）：４６－５１．