Vc二步发酵新菌种单因素发酵条件的研究

摘 要：采用产酸菌（氧化葡萄糖酸杆菌）和伴生菌（巨大芽孢杆菌）混合发酵的方法，来完成Vc二步发酵过程中的糖酸转化。本文对Vc二步发酵新菌种单因素发酵条件进行了阐述。

关键词：Vc;2-酮基-L-古龙酸;二步发酵

1 Vc概述

Vc又称抗坏血酸，是一种含有6个碳原子的酸性多羟基化合物，分子式为C6H8O6，分子量为176.1。Vc是呈无色无臭的片状晶体，易溶于水，不溶于有机溶剂。在酸性环境中稳定，遇空气中氧、热、光、碱性物质，特别是由氧化酶及痕量铜、铁等金属离子存在时，可促进其氧化破坏。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans），巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），航天诱变的新菌种sp.144 （Gluconobacter oxydans sp.144）均由某制药总厂提供。

2.1.2 培养基

Vc二步发酵常规培养基。

2.2 试验方法

2.2.1 最适单因素培养条件的建立

2.2.1.1 通气量对新菌种糖酸转化率的影响

在250mL发酵摇瓶中分别装入10、20、30、40和50mL的发酵培养基，以15%接种量接入发好的种液，29℃摇床培养44h后，测2-酮基-L-古龙酸的含量并计算糖酸转化率。

2.2.1.2 温度对新菌种糖酸转化率的影响

将发好的种液以15%接种量接入发酵培养基分别以25、29和33℃摇床培养44h后测2-酮基-L-古龙酸的含量并计算糖酸转化率。

2.2.1.3 种龄对新菌系2KGA产量的影响

将种液分别培养18、20、24h后，以15%接种量接入发酵培养基，29℃170r/min振荡培养44h，测定2-KGA的含量并计算糖酸转化率。

2.2.1.4 不同初始糖量对sp.144产量的影响。

将发好的种液接入糖含量不同的发酵培养基中（分别为6%、8%、10%、12%），29℃170r/min分别振荡培养44h，用碘量法测定2-KGA的含量并计算糖酸转化率。

2.2.2 种液及发酵培养方法

参照Vc二步发酵常规培养方法。

2.2.3 2-KGA浓度的测定

用标准碘液法。

3 结果与分析

3.1 通气量对新菌种转化率的影响

通气量是Vc二步混菌发酵的重要影响因素之一。当装液量为10mL，2-KGA为74.31mg/mL时，糖酸转化率为89.31%;装液量为20mL，2-KGA为73.65mg/mL时，糖酸转化率为89.75%;装液量为30mL，2-KGA为69.93mg/mL时，糖酸转化率为82.87%;装液量为40mL，2-KGA为60.77mg/mL时，糖酸转化率为73.03%;装液量为50mL，2-KGA为52.27mg/mL时，糖酸转化率为62.23%。由此可知，在250mL发酵摇瓶中装液10～20mL可充分满足菌体代谢产酸对氧的要求。当装液量超过30mL时糖酸转化率明显降低，表明发酵体系中溶氧量的降低直接影响菌体的代谢。

3.2 培养温度对新菌种转化率的影响

对转化率的影响实质是对L-山梨糖脱氢酶和L-山梨酮脱氢酶两个产酸关键酶的影响。当温度为25℃，2-KGA为66.46mg/mL时，糖酸转化率为77.36%;温度为29℃，2-KGA为75.48mg/mL时，糖酸转化率为89.36%;温度为33℃，2-KGA为20.01mg/mL时，糖酸转化率为22.93%。由此可知，29℃左右糖酸转化率最高。充分表明，29℃时，代谢中的酶能稳定高效地发挥其催化作用。

3.3 种龄对新菌系2-KGA及转化率的影响

当种龄为18h，2-KGA为75.67mg/mL时，糖酸转化率为89.74%;种龄为20h，2-KGA为75.48mg/mL时，糖酸转化率为88.97%;种龄为24h，2-KGA为73.05mg/mL时，糖酸转化率为86.26%。由此可知，种液的种龄对发酵的产酸量和转化率都有一定的影响，对sp.144来说，最适的种子培养时间在18～20h。

3.4 接种量对新菌系2-KGA产量的影响

①由于大菌数量的增多使其不能长期维持在稳定期而走向衰亡不能维持后期小菌的生长和产酸，所以，在44h，即发酵终点，20%～30%接种量的摇瓶无法显示出发酵的优势;②由于5%接种量摇瓶中大菌含量少，不能很快达到指数期而影响小菌的正常生长和产酸，所以对sD.144而言，10%～15%接种量更能显示其发酵的优越性。

3.5 不同初始糖量对sp.144产量的影响

①L-山梨糖浓度在8%时sp.144糖酸转化率最高，当L-山梨糖浓度大于等于10%时山梨糖转化率明显降低。所以，对sp.144而言，最适的底糖浓度为8%;②4组酸量数据大体相当，这表明当2-KGA达到一定值使L-山梨糖脱氢酶、反馈性抑制，而2-KGA还原酶活性增加，致使发酵处于动态的平衡即表观的终止状态。

参考文献：

[1]尹光琳.L-山梨糖脱氢酶的纯化及性质的研究[J].微生物学通报，2015，27（02）：89-92.

[2]蔣宇扬.2酮-L-古龙酸还原酶分离纯化及其理化、酶学性质的研究[J].生物工程学报，20141，3（04）：400-405.