芦苇蒸汽爆破加酶水解制备低聚木糖的条件优化

材料与方法

1.1 试验材料

芦苇原料来自于苏州太湖，自然条件下风干，粉碎至 3～8 cm；酶解原料：芦苇在一定压力下蒸汽爆破所得；内切木聚糖酶，南京奥多福尼生物科技有限公司，酶活为6.0×104 U/g；木糖标准品，上海晶纯生化科技股份有限公司；木二糖、木三糖标准品，日本和光纯药工业株式公社；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

自制蒸汽爆破设备，主要由蒸汽发生器、汽爆罐和接收器组成；S-4800透射电镜（SEM），赛默飞世尔科技公司；722N可见分光光度计，上海科学精密仪器有限公司；高效液相色谱仪（配备2414示差折光检测器），Waters科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芦苇蒸汽爆破处理

将经过粉碎的芦苇秸秆连续加入到自制蒸汽爆破机中，在一定压力的蒸汽爆破机中维压 15 min 后瞬间泄压出料，所得爆破物料经烘干处理后备用。

1.3.2 芦苇蒸汽爆破酶解液制备

将蒸汽爆破后烘干的芦苇样品经植物粉碎机粉碎，过100目筛，按对应于汽爆芦苇不同的料液比加入去离子水，用柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液调节pH值，然后加入一定量的内切木聚糖酶（以相对于绝干芦苇的质量百分比计）在一定温度的水浴锅中进行酶解反应。酶解一段时间后，沸水浴15 min灭酶，待冷却后经布氏漏斗抽滤并洗涤滤饼3次，把所得液体转移至100 mL容量瓶中并定容至刻度，得到芦苇酶解液。

1.3.3 酶水解因素条件筛选

选取固液比、温度、初始pH值、加酶量、酶解时间5个因素，通过测定还原性糖、总糖、低聚木糖含量及计算水解率、聚合度（DP）来确定最佳酶解条件。

1.3.3.1 固液比

在固定加酶量5%（相对于芦苇干物质量）、pH值5.0、温度50 ℃、酶解时间24 h酶解条件下，研究固液比分别为1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10、1 ∶11、1 ∶12（g ∶mL）对酶解效果的影响。

1.3.3.2 温度

在固定固液比1 g ∶10 mL、加酶量5%、pH值5.0、酶解时间24 h条件下，研究温度分别为35、40、45、50、55 ℃对酶解效果的影响。

1.3.3.3 初始pH值

将固液比固定为1 g ∶10 mL、加酶量5%、温度固定为50 ℃、酶解时间24 h，分别考察pH值分别为4.4、4.6、4.8、5.0、5.2对酶解效果的影响。

1.3.3.4 加酶量

保持固液比1 g∶10 mL、pH值5.0、温度50 ℃、酶解时间24 h，研究加酶量分别为1%、3%、5%、7%对酶解效果的影响。

1.3.3.5 酶解时间

在保持固液比1 g ∶10 mL、pH值5.0、温度50 ℃、加酶量5%的条件下，研究酶解时间分别为6、12、18、20、24、26、28 h对酶解效果的影响。

1.4 分析方法

1.4.1 芦苇汽爆物料扫描电镜分析

将汽爆条件分别为 1.20、1.35、1.40、1.50、1.40 MPa加14%碱下爆破得到的芦苇物料干燥后进行扫描电镜分析。

1.4.2 木聚糖含量测定

地衣酚-盐酸法[15]测定木聚糖含量。

1.4.3 酶解液中还原糖（RS）含量测定

3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）[16]测定还原糖含量（以木糖计）。

1.4.4 酶解液中可溶性总糖（TS）含量测定

苯酚-硫酸法[17-18]測定可溶性总糖含量。

1.4.5 水解率、平均聚合度（DP）的计算

水解率=不同反应时间样品还原糖量初始样品总糖含量-初始还原糖量×100%；

平均聚合度（DP）=提取液可溶性总糖含量提取液还原糖含量×100%（用玉米芯等作物含有的木聚糖来制取低聚木糖时，最佳聚合度一般控制在1.7～1.8[19]）。

1.4.6 低聚木糖含量测定

高效液相色谱法[20]（HPLC）色谱条件：色谱柱：SHODEX UGAR KS-802，300 mm×8 mm×6 μm；流动相：高纯水；柱温：80 ℃；示差检测器温度：water2414检测器，温度50 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL。

[BT1+*5]2 结果与分析

2.1 不同汽爆条件对芦苇纤维及糖溶出的影响

从图1-A可以看出，未经任何处理的芦苇原料纤维致密紧实，表面排列较有规律。通过图1-A与图1-B、图1-C、图1-D、图1-E的图片对比可以发现，经过蒸汽爆破预处理后，芦苇纤维由原先较为平整光滑变为多处出现断裂，参差不齐；通过图1-B、图1-C、图1-E的图片对比还可以发现，爆破蒸汽压力从1.20 MPa增加至1.50 MPa，芦苇纤维断裂程度越来越深；同时，通过图1-C、图1-D图片对比可以发现，在相同压力1.40 MPa条件下，加碱爆破后芦苇纤维断裂程度更加明显。

不同汽爆预处理测定物料中木聚糖、可溶性总糖、还原性糖、低聚木糖含量见图2。随着蒸汽爆破压力从1.20 MPa增大至1.50 MPa，还原糖、可溶性总糖、低聚木糖、木聚糖含量都随之增加。同时，还可以发现1.40 MPa加碱爆破后还原糖、可溶性总糖含量较低，但加碱爆破可以得到更多的游离木聚糖，达16.03%，更有利于后续酶解产生低聚木糖。

2.2 爆破芦苇物料酶水解条件

2.2.1 固液比

从图3可以看出，随着固液比的增加，总糖、低聚木糖含量都是先增加后下降，还原性糖虽然在增加，但不太明显，这可能是由于低聚木糖酶优先水解长链木聚糖，产生木四糖、木五糖或者更长链的木聚糖。从图4可以看出，随着固液比的增加，水解率先增大后减小，在固液比1 g ∶10 mL时达到最大值，为51.28%，此时聚合度（DP）达到1.7，在最佳生产低聚木糖范围内。综上所述，选择固液比1 g ∶10 mL作为最佳酶解条件。

2.2.2 酶解温度

从图5、图6可以看出，可溶性总糖、还原糖、低聚木糖含量和水解率均随温度升高表现先升高后降低的趋势，当温度达到45 ℃时达到峰值，分别为 25.56%、14.04%、20.08%、51.84%，聚合度在45 ℃时达到1.8，在最佳生产低聚木糖的范围内。因此，45 ℃是最佳的酶解温度。

2.2.3 酶解液pH值

从图7、图8可以看出，还原糖、可溶性总糖、低聚木糖的含量及水解率的数值均随初始pH值升高表现先升高后降低的趋势，当反应体系初始pH值为4.8时数值达到峰值，分别为24.59%、13.92%、19.00%、51.28%，在45 ℃时聚合度为1.8，也在最佳生产低聚木糖的聚合度范围内。因此，pH值为4.8是最佳初始条件。

2.2.4 加酶量

从图9、图10可以看出，随着加酶量的增加，还原糖、总糖、低聚木糖含量都在上升，当加酶量从5%增至7%时，可溶性总糖含量略有增加，还原糖含量反而有所下降， 同时低聚木糖含量也略有下降。水解率也随着加酶量的增加而上升，当加酶量为7%时水解率比5%有所下降。因此，5%为合适的酶添加量。

2.2.5 酶解时间的影响

从图11、图12可以看出，随着酶解时间的延长，还原糖、总糖、低聚木糖含量在持续增加，三者都在酶解时间为24 h时达到最大值，此时的聚合度为1.7，在适合生产低聚木糖的聚合度范围内，24 h以后总糖、还原糖含量基本没有增加，低聚木糖含量反而有所下降，这可能是低聚木糖水解成单糖，这不利于低聚木糖的生产，因此，24 h是最佳的酶解时间。

选取最佳酶解条件即固液比1 g ∶10 mL、温度50 ℃、初始pH值4.8、加酶量5%、酶水解时间24 h为优化条件进行试验，测定酶解液中糖含量，结果还原糖含量为 3.51 mg/mL，可溶性总糖含量为6.39 mg/mL，此时平均聚合度为1.8，在最佳生产低聚木糖的DP范围内；同时采用HPLC分析酶解液中各物质组分，图谱结果见图13，酶解液中低聚木糖含有较多木二糖和少量木三糖， 分别占样品含量的 12.3%、1.7%，低聚木糖的含量占芦苇干物质量的14.0%，占可溶性总糖含量的54.9%。

2.3 最佳酶解条件下时间对低聚木糖各组分的影响

选取最佳酶解条件pH值4.8、加酶量5%、固液比 1 g ∶10 mL、酶解温度50 ℃，时间选取6、12、18、20、24、26、28 h 7个时段，采用高效液相色谱法分别测定低聚木糖各组分的含量（图14）。从图14可以看出，芦苇物料蒸汽爆破加酶水解后得到的低聚木糖中只含有木二糖、木三糖，木二糖含量远高于木三糖，表明此酶解方法较适合生产单一低聚木糖——木二糖。

木二糖含量随着酶解时间延长，表现先增加后减少，在24 h时达到最大值，占干物质量的14.05%，24 h后含量下降；木三糖含量比木二糖含量少，在12 h基本达到最大值，从12～24 h增加了0.13%，24 h后含量缓慢下降。低聚木糖只含有木二糖和木三糖，低聚木糖的含量就是二者之和。低聚木糖含量在24 h时达到最大值，占干物质量的14.05%。

3 讨论与结论

低聚木糖是一种具有优异生理学性能和高附加值的新兴功能性低聚糖产品，目前，已广泛应用于医药、功能性食品、饲料添加剂等方面[21-23]。杨瑞金等采用干法和湿法蒸煮处理玉米芯连渣一起酶解生产低聚木糖[24]，李里特等以蒸汽喷爆法预处理玉米芯得到的汽爆液生产低聚木糖[25]。本研究使用废弃芦苇秸秆为原料生产低聚木糖，不仅使生产低聚木糖的原料范围更加宽阔，而且大大节约了成本。

蒸汽爆破的目的是将物料半纤维素中的木聚糖尽可能与其他物质分开，部分水解游离出来，使之能充分地与木聚糖酶接触，提高酶解的效率与产物收率[25]。试验结果表明，蒸汽爆破可以有效破坏芦苇物料表面形态特征，更有利于与酶进行接觸。传统酶法制备低聚木糖一般先用碱将木聚糖提取出来然后酶法水解，需要消耗原料干质量60%～120%的碱和较长的提取时间，同时还会产生大量碱液[26-27]。碱性汽爆相比于一般预处理方式更有利于生产低聚木糖，芦苇物料在碱的作用下木聚糖侧链乙酰基断裂，木聚糖以大分子的形式游离出来，因此产生游离单糖较少，更有利于酶解。本研究中选用14%的用碱量进行蒸汽爆破，只需消耗 15 min，爆出物料废液较少，在最佳条件（固液比1 g ∶10 mL、温度45 ℃、pH值4.8、加酶量5%、酶解时间24 h）下酶解后，低聚木糖得率能达到14.0%，且低聚木糖中主要含有木二糖，占干物质量的12.3%，还含有少量木三糖，占干物质量的1.7%。本试验还在此基础上研究了酶解后低聚木糖单一组分含量随时间的变化规律，为生产单一组分低聚木糖提供了依据，填补了同类研究的空白。

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