草甘膦对巴西橡胶树芽接苗叶片莽草酸和4种激素含量的影响

材料，喷施188 g a.i/hm2的草甘膦剂量，分析芽接苗不同形态叶片莽草酸和4种激素含量变化规律。结果表明：莽草酸积累量在草甘膦施药前后呈显著差异，当叶片出现半黄半绿表型时，莽草酸积累量较未施药前上升12.40%，而在2种再生畸形叶（叶片长度<7 cm和>7 cm）和恢复叶时分别下降75.01%、77.48%和62.69%；喷施草甘膦后各类型叶片生长素和赤霉素的含量均与未施药前对照叶片差异不显著，脱落酸和玉米素含量较对照差异显著，半黄半绿叶片脱落酸含量较未施药对照下降12.40%，玉米素较施药前下降33.54%；2种再生畸形叶出现后，脱落酸含量较未施药前分别升高30.40%和45.61%，玉米素分别升高41.48%和86.02%。说明莽草酸和植物激素共同调节着橡胶树的生长，且影响了橡胶树叶片畸形。

关键词 巴西橡胶树 ；草甘膦 ；莽草酸 ；激素

中图分类号 S794.1 文献标志码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.11.011

Abstract The mechanism of glyphosate spraying on the induction to the distortion of the rubber tree grafting budding seedling leaf is unclear. In this study， rubber variety CATAS 7-33-97 grafting budding seedlings leaves sprayed 188 g a.i/hm2 of glyphosate dose， were used for analysis of shikimic acid and 4 kinds of hormone contents. Results show that the accumulation of shikimic acid in leaves before and after glyphosate spraying was significantly different. When in half yellow half green leaf phenotype， shikimic acid accumulation is up 12.40% before spraying， and in two regeneration deformed leaf （less than 7 cm and more than 7 cm length） and restoring leaf fell by 75.01%， 77.48% and 75.01%， respectively. Auxin and GA3 contents in various types of leaves after glyphosate spraying show no significant differences compared with leaves before spraying， while significant difference are found in content of abscisic acid and zeatin. Abscisic acid and zeatin contents in half yellow half green leaf fell by 12.40% and 33.54 than control leaf， respectively. In two regeneration deformed leaf， abscisic acid content is increased 30.40% and 30.40%， zeatin is increased 41.48% and 86.02% than control leaf， respectively. The results showed that shikimic acid and hormones regulated the growth of rubber tree together， and affected the the leaf of rubber tree distorted.

Keywords Hevea brasiliensis Muell. Arg. ； glyphosate ； shikimic acid ； hormone

草甘膦（Glyphosate）是由孟山都公司开发的高效、广谱的内吸传导型灭生性除草剂[1]。在使用过程中草甘膦药液飘移往往会使作物受到药害，甚至会导致作物死亡[2]。草甘膦抑制5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvoylshikimate-3-phosphate-synthase， EPSPS）活性，导致莽草酸含量大量积累，从而影响植物细胞分裂和叶绿素等生理代谢功能[3]。莽草酸积累量是草甘膦对作物生理机制影响的重要指标[4-5]。

生长素（Auxin， IAA）、玉米素（Zeatin， ZR）、赤霉素（Gibberellin， GA3）和脱落酸（Abscisic acid， ABA）是主要的植物内源激素，与植物的基因表达、生长发育和代谢等过程密切相关[6]。IAA调控花序、花分生组织以及花器官的发育[7]。ABA在水分胁迫下对植物气孔运动[8-9]、种子萌发、开花时间和果实成熟等生理过程中起到重要调节作用[10-12]。GA3促进种子萌发和植物生长[13]，降低植物对逆境的抵御能力[14]，在植物的生物合成和信号传导方面发挥重要的作用[15]。ZR属于细胞分裂素的一种，能够促进细胞分裂、分化，维持蛋白质合成的正常机能[16]。

已有研究结果表明，在喷施草甘膦后，大豆的莽草酸积累量增加会使植株死亡[17]。草甘膦诱导棉花花药中生长素、赤霉素、脱落酸和玉米素含量产生变化导致花粉粒畸形[18-19]。在草甘膦的作用下，生长素含量的变化引起棉花和玉米叶片扭曲[20]。草甘膦与赤霉素作用可以促进玉米生长[21]。巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）幼苗生长过程中需要进行杂草防除，草甘膦喷施过程中会因人为、环境等因素沾溅到橡胶树叶片上，被橡胶树吸收传导，导致草甘膦药害产生。笔者推测，在草甘膦处理下，莽草酸和激素含量的变化会影响橡胶树叶片畸形。因此，笔者采用巴西橡胶树‘热研7-33-97’芽接苗为材料，探析草甘膦处理后巴西橡胶树幼苗不同形态叶片中莽草酸和激素含量的变化规律，以期更深入地了解草甘膦对巴西橡胶树幼苗叶片畸形的原因，为研究草甘膦对巴西橡胶树作用机制打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以中国热带农业科学院橡胶研究所培育的巴西橡胶树品种‘热研7-33-97’一年生芽接苗为材料，芽接苗种植于海南大学环境与植物保护学院（儋州校区）实验基地，草炭土与粘土体积比例为3∶1的育苗袋中。

41%草甘膦水剂，由浙江绿野农化生物科技有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

将41%草甘膦有效剂量188 g a.i/hm2，喷施在‘热研7-33-97’芽接苗第一蓬叶，每批处理6株，每株取叶柄中间的一片叶片进行分析。以下5种形态叶片进行测定：（1）未施药前叶片（对照）；（2）3～5 d半黄半绿叶片；（3）30 d再生<7 cm畸形叶；（4）>7 cm畸形叶；（5）36 d再生恢复叶。

1.2.2 莽草酸含量测定

莽草酸含量测定参考Gaitonde[22]、娄远来[23]和王迪[24]等的方法，稍作改动。用液氮分别研磨未施药前叶片、半黄半绿叶片、小于7 cm畸形叶、大于7 cm畸形叶和新生的恢复叶，各取0.2 g样品于2.0 mL离心管，加入0.25 mol/L HCL 1.0 mL，4℃，12 000 r/min下离心30 min。然后取200 μL上清液于10 mL离心管，加入2.0 mL氧化剂溶液（1%高碘酸和1%过碘酸钠溶液混合），室温静置3 h，加入 1.0 mol/L NaOH溶液2.0 mL，最后加入0.1 mol/L甘氨酸1.2 mL 混匀，静置5 min，用紫外分光光度计在380 nm比色，以0.25 mol/L HCL为空白对照。

莽草酸标准曲线制作：取莽草酸的标准样品0.01 g，溶于1 mL的0.25 mol/L HCL，混匀，分别取5、10、25、37.5、50 μL于1.5 mL离心管，加0.25 mol/L HCL溶液，定容至1.0 mL，以下步骤同莽草酸含量测定，并绘制标准曲线。

1.2.3 4种内源激素含量测定

参考陈建华[25]和马有宁[26]等的方法，稍作激素前处理改动：用液氮分别研磨未施药前叶片、半黄半绿叶片、小于7 cm畸形叶、大于7 cm畸形叶和新生的恢复叶，各取0.5 g样品于5 mL 80%冰冻色谱纯甲醇（含0.1%酮试剂）里，4℃避光提取过夜，13 000 r/min ，4℃下离心10 min，滤纸过滤后，加入20 μL氨水，在旋转蒸发仪上40℃加压蒸发至水相，然后加入乙酸乙酯1 mL萃取，在35℃浓缩至近干，提前分别用10 mL色谱纯甲醇和灭菌的超纯水活化迪马公司PXC小柱，处理好的样品过PXC小柱，先用10 mL 0.1 mol/L的HCL淋洗柱子，再用10 mL色谱纯甲醇洗脱，洗脱液在40℃下减压蒸发至近干，用1 mL色谱纯甲醇溶解，0.22 μm无机滤膜过滤，-80℃保存或待测。

4种内源激素含量测定：采用酶联免疫（ELISA）分析试剂盒法（双抗体夹心法）测定IAA（生长素）、GA（赤霉素）、ABA（脱落酸）和ZR（玉米素）4种内源激素，加入准备好的样品和标准品，空白对照不加样品及酶标试剂，其余步骤相同：37℃反应30 min；洗板5次，加入酶标试剂（避光），37℃反应30 min；洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10 min；加入终止液，15 min内在酶标仪上读OD值，最后制作标准曲线并带入计算。

1.2.4 数据统计

实验测定为3次重复，采用SAS 9.1.3对数据进行单因素方差分析和多重比较分析，采用Excel 2013软件进行数据处理和作图。

2 结果与分析

2.1 对芽接苗不同时间形态的影响

将草甘膦稀释液喷施在橡胶树幼苗第一蓬叶片上，不同时间叶片症状如图1。从图1可以看出，图1-A为对照，草甘膦喷施3～5 d后橡胶树幼苗叶片变黄（图1-B），10～15 d叶片脱落。叶片脱落后，橡胶树幼苗枝条开始分蘖、长芽，同时长出第二蓬叶。约30 d第二蓬叶片稳定，呈细长、卷曲形（图1-C）。约35 d第二蓬新生的叶片形状会有所恢复，但是仍长于正常叶片（图1-D），这说明草甘膦对橡胶树幼苗叶片产生一定的影响。

2.2 对芽接苗叶片中莽草酸和4种激素含量的影响

2.2.1 对莽草酸含量的影响

草甘膦喷施橡胶树幼苗后，按照试验方案进行采样，并测定莽草酸含量，数据显示，其幼苗在不同形态叶片中莽草酸含量有一定的变化（图2）。由图2可知，莽草酸含量未施药前叶片、半黄半绿叶、<7 cm畸形叶、>7 cm畸形叶和恢复叶分别为1 521.13、1 709.82、380.06、342.56和567.56 μg/g FW，呈下降趋势。叶片出现半黄半绿时其莽草酸有一定积累，较未施药前升高了12.40%，随后畸形叶出现时，莽草酸积累量逐渐下降，分别比未施药前下降75.01%和77.48%；而当新生叶片恢复时莽草酸积累量有所升高，但相对未施药前下降62.69%。说明草甘膦只在施药前期中断橡胶树幼苗莽草酸的途径，使其不能分解下游产物，橡胶树幼苗后期莽草酸积累量减少，可能由于环境变化或植株自身代谢将草甘膦分解。

2.2.2 对4种激素含量的影响

为了探求叶片扭曲对植物内源激素的影响，测定5种不同叶片形态下ABA（脱落酸）、GA3（赤霉素）、IAA（生长素）、ZR（玉米素）4种激素含量（图3）。由图3可以看出，未施药前叶片、施药后半黄半绿叶片、<7 cm畸形叶、>7 cm畸形叶和新生的恢复叶IAA含量分别为25.79、22.74 、24.31、25.60和27.04 pmol/L；GA3含量分别为69.0、139.60、159.92、167.26和196.45 pg/mL。橡胶苗从施药到长出恢复叶的过程中，IAA和GA3含量都呈现缓慢上升，与对照差异不明显。未施药前叶片、施药后半黄半绿叶片、<7 cm畸形叶、>7 cm畸形叶和新生的恢复叶ABA含量分别为100.82、88.32、131.47、146.80和124.84 μg/L，叶片处于半黄半绿时ABA含量较对照下降12.40%，而在畸形叶和恢复叶中ABA含量分别较未施药前升高30.40%、45.61%和23.82%。橡胶苗从施药到长出恢复叶的过程中，ZR含量分别为146.23、97.19、206.89、272.02和123.42 ng/L，叶片处于半黄半绿和恢复叶时，ZR含量较对照分别下降33.54%和15.60%，而在畸形叶中ZR含量分别较未施药前升高41.48%、86.02%，说明草甘膦影响橡胶树生长过程中激素含量的运输及分布。

3 讨论与结论

近年来，随着劳动力成本的增加，草甘膦的用量不断上升，已成为市面上应用最广的除草剂品种[27]。草甘膦在施药过程中，地面或航空喷雾的飘移对作物造成的药害已成为生产中急需解决的问题[28-30]。

草甘膦竞争性抑制莽草酸合成途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性，因此，提高EPSPS活性，可以将植物体内多余的莽草酸代谢掉，保证芳香族氨基酸的正常代谢[31]。国内外研究结果表明：在喷施草甘膦后，正常植物体内莽草酸含量上升，植物EPSPS酶活性受到抑制。在大豆实验中，被草甘膦处理的常规大豆中莽草酸含量随药害天数逐渐增加，最终导致植株死亡[32]。对比研究发现，经草甘膦处理后不同形态橡胶树叶片的莽草酸含量较对照组反而下降。说明橡胶树可能受外界因素或是自身代谢作用的影响，导致本研究结果与大豆实验不同。另有研究结果表明，草甘膦可以降低棉花花粉活性，产生畸形花，可能是棉花受到草甘膦胁迫产生了抗性基因，具有抗性基因的EPSPS酶将莽草酸转化为EPSP[33]，使莽草酸含量没有积累。

植物激素既可以调节植物生长，也可以在逆境中维持植物的生长[34]。有研究结果表明，IAA、GA、ZR的含量不足会导致花药在减数分裂时期得不到足够的底物和能量。在刘吉焘等[18]的棉花实验中，草甘膦作用下，棉花花粉败育，植株体内IAA、GA、ZR的含量低于正常植株，ABA的含量则高于正常植株。在本研究中，草甘膦处理下，橡胶树不同形态叶片中IAA和GA3含量都呈缓慢上升，但较对照无明显差异。说明橡胶树在草甘膦作用下，IAA和GA3含量变化影响不大。ABA和ZR在橡胶树畸形叶中含量显著升高，ABA含量高，会抑制细胞生长和促进细胞衰老死亡[18]。ABA和ZR在草甘膦作用下，能够抑制橡胶树叶片中细胞生长，橡胶树叶片畸形可能是其在逆境中所表现的一种应激反应。

本实验通过对巴西橡胶树叶片中莽草酸含量和4种激素含量的分析发现，草甘膦导致橡胶树叶片畸形时，莽草酸含量显著降低。脱落酸和玉米素含量显著升高，说明莽草酸和植物激素共同调节着橡胶树的生长，且影响了橡胶树叶片畸形。

参考文献

[1] 武 骁. 草甘膦抗性研究进展[J]. 世界农药，2014，36（5）：15-19.

[2] Amrhein N， Deus B， Gehrke P. The Site of the Inhibition of the Shikimate Pathway By Glyphosate：Ⅱ.Interference of Glyphosate with Chorismate Formation in Vivo and in Vitro[J]. Plant Physiol， 1980， 66（5）： 830-834.

[3] 高 越，刘 辉，陶 波. 抗草甘膦野生大豆筛选及其抗性生理机制研究[J]. 大豆科学，2013，32（1）：76-79.

[4] Stanton R A， Pratley J E， Hudson D， et al. A risk calculator for glyphosate resistance in Lolium rigidum （gaud.）[J]. Pest Manaq Sci， 2008， 64（4）： 402-408.

[5] Pline W A， Wilcut J W， Duke S O， et al. Tolerance and Accumulation of Shikimic Acid in Response to Glyphosate Applications in Glyphosate-resistant and Nonglyphosate-resistant Cotton （gossypium Hirsutum.）[J]. Agricultural and Food Chem， 2002， 50（3）： 506-512.

[6] 许智宏，李家洋. 中国植物激素研究：过去、现在和未来[J]. 植物学通报，2006，23（5）：433-442.

[7] Barazesh S， Mcsteen P. Hormonal control of grass inflorescence development[J]. Trends in Plant Science， 2008， 13（12）： 656-662.

[8] 李保珠，安国勇，韩 栓. 植物激素ABA在水分胁迫下的功能及信号途径[J]. 植物生理学报，2012，48（1）：11-18.

[9] 赵 翔，李 娜，王棚涛. 脱落酸调节植物抵御水分胁迫的机制研究[J]. 生命科学，2011，23（1）：115-120.

[10] Bolle C. The role of GRAS proteins in plant signal transduction and development.[J]. Planta， 2004， 218（5）： 683-692.

[11] Fleet C M， Sun T P. A DELLAcate balance： the role of gibberellin in plant morphogenesis[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005， 8（1）： 77-85.

[12] Reddy K N， Bellaloui N， Zablotowicz R M. Glyphosate Effect on Shikimate， Nitrate Reductase Activity， Yield， and Seed Composition in Corn[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2010， 58（6）： 3 646-3 650.

[13] 顾振新，陈志刚，蒋振晖. 赤霉素处理对糙米发芽力及其主要成分变化的影响[J]. 南京农业大学学报，2003，26（1）：74-77.

[14] Thomas S G， Sun T P. Update on gibberellin signaling. A tale of the tall and the short.[J]. Plant Physiology， 2004， 135（2）： 668-676.

[15] 魏灵珠，程建徽，李 琳，等. 赤霉素生物合成与信号传递对植物株高的调控[J]. 生物工程学报，2012，8（2）：144-153.

[16] 王兆龙，曹卫星. 细胞分裂素对植物基因表达的调节[J]. 生理学通讯，2000，6（1）：82-88.

[17] 杨鑫浩，李香菊. 草甘膦对耐草甘膦大豆体内莽草酸含量及产量的影响[J]. 杂草科学，2014，2（1）：78-82.

[18] 刘吉焘，狄佳春，陈旭升. 草甘膦诱导抗草甘膦棉花花药中激素和游离氨基酸含量的变化[J]. 分子植物育种，2014，12（3）：530-536.

[19] 孟庆忠，王贵春，李国荣，等. 草甘膦作为棉花杀雄剂应用研究初报[J]. 湖北农业科学，2010，49（11）：2 706-2 708.

[20] Baur J R. Effect of Glyphosate on Auxin Transport in Corn and Cotton Tissues[J]. Plant Physiol.， 1979， 63（5）： 882-886.

[21] 李小艳，许 晅，李桂俊. 赤霉素对草甘膦的增效作用及其作用机制[J]. 南京农业大学学报，2013，36（3）：36-40.

[22] Gaitonde M K， Gord M W. A Microchemical Method for the Detection and Determination of Shikimic Acid [J]. Biol Chem， 1958， 230（2）： 1 043-1 050.

[23] 娄远来，邓渊钰，沈晋良. 甲磺隆和草甘膦对空心莲子草乙酰乳酸合酶活性和莽草酸含量的影响[J]. 植物保护学报，2005，32（2）：185-188.

[24] 王 迪. 抗草甘膦野生大豆资源筛选鉴定及抗性机理研究[D]. 河北：河北科技师范学院，2014.

[25] 陈建华，曹 阳，李昌珠，等. 板栗内源激素的高效液相色谱测定方法[J]. 中南林学院学报，2004，24（5）：39-41.

[26] 马有宁，陈铭学. 植物内源激素预处理方法与色谱检测技术的研究进展[J]. 中国农学通报，2011，27（3）：15-19.

[27] 苏少泉. 草甘膦述评[J]. 农药，2005，44（4）：145-149.

[28] Bellaloui N， Reddy K N， Zablotowicz R M， et al. Simulated glyphosate drift influences nitrate assimilation and nitrogen fixation in non-glyphosate-resistant soybean.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2006， 54（9）： 3 357-3 364.

[29] Reddy K N， Ding W， Zablotowicz R M， et al. Biological responses to glyphosate drift from aerial application in non-glyphosate-resistant corn[J]. Pest Management Science， 2010， 66（10）： 1 148-1 154.

[30] 杨治峰，张振玲. 草甘膦生殖发育毒性的研究进展[J]. 环境与职业医学，2013，30（2）：154-156.

[31] 原向阳，郭平毅，张丽光. 不同时期喷施草甘膦对大豆生理指标的影响[J]. 中山大学学报，2009，48（2）：90-94.

[32] 杨鑫浩. 大豆对草甘膦耐受性检测方法研究[D]. 北京：中国农业科学院，2014.

[33] 卜贵军. 草甘膦对大豆叶片生理和形态结构的影响[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2009.

[34] Peleg Z， Blumwald E. Hormone balance and abiotic stress tolerance in crop plants[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2011， 14（3）： 290-295.