雷公藤甲素体外对人表皮干细胞增殖的调控作用

【摘要】 目的：探讨雷公藤甲素体外对人表皮干细胞增殖的影响。方法：应用中性蛋白酶-Ⅳ型胶原黏附方法分离正常人的包皮表皮干细胞，采用细胞免疫组化法检测培养传代细胞的角蛋白19（CK19）、角蛋白10（CK10）、β1整合素表达，鉴定人表皮干细胞。培养传代细胞中加入不同浓度的雷公藤甲素，用倒置显微培养后观察细胞的形态学变化，应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞的增殖情况，探索雷公藤甲素对人表皮干细胞增殖的影响。结果：免疫组化法检测提示培养传代细胞，β1整合素、CK19表达阳性，CK10表达阴性，MTT法检显示雷公藤甲素能显著抑制人表皮干细胞的增殖，且存在一定的浓度依赖性。结论：雷公藤甲素能有效抑制人表皮干细胞增殖。

【关键词】 雷公藤甲素； 表皮干细胞； 增殖； 角蛋白19； β1整合素

In Vitro Regulatory Effect of Triptolide on Proliferation of Human Epidermal Stem Cells/JIANG Wei-su，HE You-zhen，WANG Peng，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（22）：024-028

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Triptolide on the proliferation of human epidermal stem cells（hESCs） in vitro.Method：hESCs was isolated from human foreskin by the method of protease-collagen Ⅳ-coated adhesion.The expression of integrins β1，keratin 19 and keratin 10 on the generation of hESCs were examined by immunocytochemical method.After the generation of hESCs were cultured in epilife medium containing Triptolide of different concentrations respectively.The shape，clone formation and proliferation of the cell were observed through inverted microscope.The effect of Triptolide was evaluate by MTT method on proliferation of human epidermal stem cells in vitro.Result：The results of immunocytochemistry showed keratin 19 and intergrin β1 were positively expressed at the generation of hESCs，but keratin 10 was negative.MTT assay showed that the proliferation of human epidermal stem cells was significantly inhibited， and there was a concentration dependent.Conclusion：Triptolide can effectively inhibit the proliferation of human epidermal stem cells in vitro.

【Key words】 Triptolide； Epidermal stem cells； Proliferation； Keratin 19； Integrins β1

First-author’s address：People’s Hospital of Qingyuan，The Sixth Affiliated Hospital of Guanyzhou Medical University，Qingyuan 511518，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.22.006

中药雷公藤系卫矛科雷公藤属植物，药用其根，至今已从雷公藤属植物的提取物中分离70多种成分，生物碱及二萜类为其主要活性成分，不仅有抗癌及免疫抑制作用，还有抗类风湿作用[1-7]。目前雷公藤在我国已广泛应用于银屑病、系统性红斑狼疮、湿疹、过敏性紫癜等皮肤病的治疗，而且皮肤科的许多疾病与表皮干细胞有关[7-11]。目前尚未见雷公藤甲素体外对表皮干细胞增殖的调控作用的报道，因此选择雷公藤甲素研究其体外对表皮干细胞增殖的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠抗人β1整合素购自武汉博士德，胰蛋白酶（来自Sigma），中性蛋白水解酶来自美国Gibco公司，小鼠抗人角蛋白19（Cytokeratin 19，CK19）、CK10（Cytokeratin 10）、两步法免疫组织化学检测试剂盒（均来自为福州迈新），DMEM培养基、低糖DMEM/F12培养基（均来自Gibco），胎牛血清（来自Hyclone），人胶原Ⅳ（来自Sigma），表皮生长因子（EGF，来自Promega），雷公藤甲素（中国医学科学院皮肤病研究所，纯度为99%）。

1.2 方法

1.2.1 中性蛋白水解酶配制 用D-Hanks 溶解中性蛋白水解酶25 mg，定容至100 mL，过滤除菌，4 ℃保存。

1.2.2 Ⅳ型胶原包被 按参考文献[12-13]方法进行，将Ⅳ型胶原溶解于0.1%醋酸溶液中至终浓度为100 mg/L，经过滤过除菌，4 ℃保存备用。应用配制好的Ⅳ型胶原溶液2 mL平铺在培养瓶中，取配制好的Ⅳ型胶原溶液10μL涂满96孔板，置4 ℃冰箱中过夜，弃上清液，然后用0.01 mol/L PBS漂洗

3次，洗去未贴壁多余的胶原，4 ℃干燥箱烘干，再用紫外线照射2 h消毒，得到预铺的IV型胶原培养瓶和96孔培养板。

1.2.3 雷公藤甲素应用液制备 将雷公藤甲素粉剂溶解于DMSO液中，贮存液浓度为5 mg/mL，贮存液加入适当溶剂，制备不同浓度的实验浓液。

1.2.4 表皮干细胞的分离与培养 将来自本院行包皮切除术的包皮皮片（患者年龄2～40岁，均无感染等相关疾病）共15例，所取皮片均得到患者知情同意，按参考文献[12-13]方法进行实验。将刚手术新鲜的标本用含青霉素、链霉素的PBS液冲洗8～10次，无菌条件下剔除皮下组织。标本剪成0.5 cm×0.5 cm的皮片，用中性蛋白水解酶4 ℃消化l4～16 h，弃上清液，分离表皮与真皮层。剪碎表皮，0.25%胰蛋白酶37 ℃消化15 min，加入含10%小牛血清DMEM终止消化，轻柔吹打，经200目筛网研磨滤过。滤液离心速度为1000 r/min，离心5 min收集细胞。弃上清液，立即加入表皮干细胞培养基并轻轻吹打制成单细胞悬液，接种于预先铺有Ⅳ型胶原培养瓶及96孔板内，经37 ℃孵育15 min。倒置显微镜下观察，粘附于Ⅳ型胶原包被板上的细胞则主要为表皮干细胞为实验组，再吸去未粘附细胞悬液，接种于未铺Ⅳ型胶原包被板内作为对照组，实验组加入表皮干细胞培养基，每组各选15例。两组放置于37 ℃、5% CO2孵箱培养。次日吸出培养液，用PBS冲洗1次，加入表皮干细胞培养基，置37 ℃、5% CO2孵箱中继续培养。换液2 d/次，在光镜下观察细胞生长情况。

1.2.5 表皮干细胞的传代 当培养的细胞接近70%～80%融合时，应用0.25%胰蛋白酶0.02% EDTA消化培养瓶内的细胞，按1∶2传代，传代的细胞接种在Ⅳ型胶原预先铺的96孔培养板或培养瓶中培养。

1.2.6 表皮干细胞的鉴定 按参考文献[12-13]实验方法进行，应用免疫组化染色方法检测，采取第2代表皮干细胞爬片，用4%多聚甲醛在室温下固定10 min，用两步法进行免疫组化染色试验。以对照组细胞作为对照组，具体步骤方法：滴加3%H202，置37 ℃孵育10 min，以消除内源性的过氧化物酶活性。用非免疫性的动物血清封闭后分别滴加一抗（KI9、β1整合素、CK10）；同时设空白对照组，以PBS代替一抗，4 ℃过夜。洗后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育20 min（以上各步骤间均以PBS振洗），DAB显色。

1.2.7 雷公藤甲素体外对表皮干细胞增殖的调控 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞的增殖[14-15]，取分离培养鉴定的表皮干细胞的制成单细胞悬液调整浓度为5×105/mL，接种于96孔板内，每个样本设4个复孔，0.2 mL/孔。放置培养箱内孵育，待细胞完全贴壁，然后更换含雷公藤甲素的培养液终浓度分别为100、50、25、2.5、0.25、0.025μg/mL，同时设对照组。在培养箱中分别孵育7、10、13 d后，加入20μL/孔 MTT（5 mg/mL）后孵育4 h，参照试剂说明书进行操作，用酶标仪检测吸光度（OD）计算细胞增殖活性。

1.3 统计学处理 使用SPSS 10.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养细胞的生长状况 显微镜下观察分离的细胞贴壁，细胞折光性较强，分散较均匀，细胞体积较小、圆形。培养3 d后，试验组个别细胞贴壁牢固，形成较小克隆。培养第8天，细胞连接成片，细胞间互相衔接、紧密相靠，呈铺路石状。培养至第13天形成圆形、椭圆形、不规则形大克隆，大部分融合。

2.2 细胞免疫化学染色结果 试验组细胞的CK10细胞免疫化学染色显示为阴性，β1整合素、CK19细胞免疫化学染色显示培养细胞的胞浆内出现棕黄色的表达为阳性。

2.3 MTT法检测 表皮干细胞经雷公藤甲素处理后，各组细胞的生长受到不同程度抑制，浓度不同抑制强度不同，在一定的浓度范围内，浓度越高抑制作用越大，随雷公藤甲素浓度的变化而变化，见表1。（1）7 d OD，雷公藤甲素浓度为0.025、0.25μg/mL时两组比较差异均无统计学意义（P>0.05），其他浓度比较差异均有统计学意义（P<0.05）。实验组组内比较：雷公藤甲素浓度为0.025μg/mL与0.25μg/mL比较差异无统计学意义（P>0.05），与其他浓度比较差异均有统计学意义（P<0.05）；雷公藤甲素浓度为0.25μg/mL与2.5、25、50、100μg/mL比较差异均有统计学意义（P<0.05）；雷公藤甲素浓度为2.5μg/mL与25μg/mL比较差异无统计学意义（P>0.05），与50、100μg/mL比较差异均有统计学意义（P<0.05）；浓度为25μg/mL与50、100μg/mL比较差异均无统计学意义（P>0.05）。（2）10 d OD，雷公藤甲素浓度为0.025、0.25μg/mL时两组比较差异均无统计学意义（P>0.05），其他浓度比较差异均有统计学意义（P<0.05）。实验组组内比较：雷公藤甲素浓度为0.025μg/mL与0.25、2.5μg/mL比较差异无统计学意义（P>0.05），与25、50、100μg/mL

比较差异均有统计学意义（P<0.05）；雷公藤甲素浓度0.25μg/mL与2.5、25μg/mL比较差异均无统计学意义（P>0.05），与50、100μg/mL比较P<0.05；浓度2.5μg/mL与25 μg/mL比较P>0.05，与50、100μg/mL比较差异均有统计学意义（P<0.05）；浓度25μg/mL与50μg/mL比较差异无统计学意义（P>0.05），与100μg/mL比较差异均有统计学意义（P<0.05）；浓度50μg/mL与100μg/mL比较差异无统计学意义（P>0.05）。

（3）13 d OD时不同浓度雷公藤甲素体外对表皮干细胞增殖的影响情况与（2）类似，见表1。

3 讨论

当前国内外对表皮干细胞的增殖分化调控尚处于探索阶段，中药雷公藤系卫矛科雷公藤属植物，其中二萜类及生物碱为其主要有效活性成分。中药现代药理试验证实其具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗生育等作用，已被广泛应用于银屑病、系统性红斑狼疮、过敏性皮肤病、肾炎、类风湿性关节炎等诸多疾病治疗[16-17]。MTT比色法又称MTT法，是一种检测细胞存活和生长情况常用方法，已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、生物活性因子的活性检测、细胞增殖活性检测、细胞毒性试验等[18]。本课题研究发现，经雷公藤甲素处理后的各组细胞的生长受到不同程度抑制，浓度不同抑制强度不同，在一定的浓度范围内对照组与实验组比较，随着雷公藤甲素浓度的升高，雷公藤甲素对表皮干细胞的抑制程度增强，浓度越高抑制作用越大；实验组内比较显示：雷公藤甲素浓度越高对表皮干细胞的抑制程度也越强，随着雷公藤甲素浓度的变化而变化。说明雷公藤甲素体外对表皮干细胞增殖分化有较强的调控作用，可以解释雷公藤用于许多皮肤病的治疗原因，例如：银屑病（psoriasis）是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，基本损害为红色丘疹或斑块上覆有多层银白色鳞屑，病理生理的一个重要特点是表皮基底层的角质形成细胞增殖加速，表皮更替时间缩短，组织病理上出现角化不全，颗粒层消失。雷公藤甲素对银屑病患者的表皮干细胞增殖分化有较强抑制作用，使细胞增殖速度差减慢，恢复正常增殖速度，这可能是雷公藤治疗银屑病的机理之一。目前研究发现皮肤科的许多疾病与表皮干细胞有关，表皮干细胞在一定条件下可以转化为其他干细胞，其也积极参与皮肤损伤后的修复，是皮肤发生、重塑和修复的关键性细胞[19-25]。表皮干细胞具有慢周期性，自我更新能力强，与皮肤基底膜粘附紧密，体外培养时有较高的克隆形成率等特点[14，24]。随着中药对表皮干细胞的增殖分化调控研究的深入，中药治疗皮肤病的神秘面纱将被揭示，将为其迈向国际化市场提供理论基础，造福全世界。

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（收稿日期：2016-01-22） （本文编辑：周亚杰）