珍稀蕨类植物蛇足石杉药用有效成分研究进展

摘 要：蛇足石杉由于能治疗阿尔茨海默病（AD）等疾病，因而具有特殊的药用价值，日益受到国内外的关注。本文综述了近年来蛇足石杉药用有效成分如生物碱、三萜化合物等的药理作用及其分离提取工艺，总结了其在医学、基因工程领域的研究进展，为蛇足石杉药用有效成分可持续利用研究提供参考。

关键词：蛇足石杉；药用有效成分；基因

中图分类号：R282.71 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.08.007

Abstract： Huperzia serrata has been drawing increasing concerns from home and abroad for its special medicinal value in treating Alzheimer"s Disease （AD） and other diseases. Pharmacological effects and process of separation and purification of its effective ingredients such as huperzia seratta alkaloids and triterpenoid compound in recent years were illustrated in this paper. Furthermore， its research progress in fields of medicine， genetic engineering was summarized， aiming to provide references for sustainable utilization of effective medicinal ingredients in Huperzia serrata.

Key words： Huperzia serrata； medicinal active ingredients； gene

珍稀蕨类植物蛇足石杉（Huperzia serrata （Thunb. ex Murray）Trev.）为石杉科多年生草本植物，又称千层塔、蛇足草、山芝、金不换等。在我国主要分布于福建、两广、东北和长江流域等地区，在朝鲜、日本、大洋洲、美洲中部也有分布。在我国民间，多作跌打损伤、毒蛇咬伤、精神分裂、肌肉痉挛和其它疾病的中药材[1]。数十年来，国内外学者对蛇足石杉中石杉碱甲（Huperzine-A，Hup-A）药理作用的广泛关注，促进了对其相关药用有效成分的研究。本研究对蛇足石杉中多种药用有效成分及其药理作用、基因工程的研究进行整理归纳，为蛇足石杉有效成分可持续利用提供参考。

1 蛇足石杉的有效成分

蛇足石杉的有效成分主要有生物碱、三萜类化合物和黄酮类化合物等，相关研究主要集中在生物碱上。

1.1 生物碱

1972年，沈文照等首次报道石杉碱甲具有横纹肌松弛作用后，引发对蛇足石杉生物碱的全面研究[2]，目前已分离并鉴定90多种。蛇足石杉生物碱属于一种石松生物碱。加拿大科学家Ayer[3]根据石松生物碱的化学结构将其分为lycopodine型、lycodine型、fawcettimine型和miscellaneous型4种类型。迄今为止，从蛇足石杉分离得到的生物碱大多数属于fawcettimine型石松生物碱，而具有抑制乙酰胆碱脂酶（AChE）活性的生物碱如Hup-A等则属于lycodine型石松生物碱，且Hup-A的含有量在蛇足石杉全草甚微，因此新的研究热点主要集中在Hup-A类似物的人工合成和蛇足石杉体内其它具有抑制AChE活性生物碱结构改造上。在对蛇足石杉全草的有效成分含量研究中，Hup-A含量最高出现在叶，茎和根中的含量则较低[4]。全草中Hup-A含量随季节变化而变化，12月>9月>6月>3月[5]。Hup-A含量因产地不同略有不同，提取工艺对其含量影响甚微。

1.2 三萜类化合物

蛇足石杉三萜是具有多种结构类型及丰富生物活性的石杉科植物三萜类物质的代表化合物，又称锯齿石松烷三萜。此外，蛇足石杉三萜的化学结构属于特殊的五环三萜，且骨架C环为七元环。按照五环骨架上含氧官能团的数量，可以分为二醇（diol）类、三醇（triol）类、多醇类3种类型。目前已分离得到千层塔尼醇、16氧千层塔三醇、千层塔萜二醇、21氧千层塔萜烯三醇和千层塔三醇等30多种[6]。虽然多种三萜类化合物在蛇足石杉中被分离出来，但目前的研究主要集中在其分离及生理活性的研究上，有关生物合成途径的报道较少。

1.3 其他成分

黄酮类化合物和甾体等药用有效成分也被从蛇足石杉中分离得到。鲁翠涛等[7]初步确定蛇足石杉中的黄酮类物质主要为黄酮类和黄酮醇类，马燮等[8]测得蛇足石杉全草含0.879%的总黄酮类化合物。应用波谱分析技术，蒋金和等[9]实现了蛇足石杉中的β-谷甾醇和胡萝卜甙的鉴定。

2 蛇足石杉药用有效成分的提取工艺

蛇足石杉药用有效成分含量极低，因此其提取和分离纯化方法的选择尤为重要。

2.1 生物碱的提取与纯化

蛇足石杉生物碱的提取方法主要有以下几种：（1）酸提法。用2%HCl提取蛇足石杉生药粗粉中的总生物碱，获得Hup-A。（2）醇法。大多数生物碱溶于酯溶性溶剂氯仿或甲醇、乙醇等，因此可用95%乙醇提取蛇足石杉全草中的生物碱。（3）超声提取法。应用超声波的空化作用，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高小分子物质溶出速度和溶出次数，缩短提取时间。查圣华等[10]采用超声提取法提取Hup-A和Hup-B，不但提取时间由2 h缩短到15 min，提取率也提高了10%。（4）微波辅助法。微波加热使细胞壁和细胞膜上出现孔洞和裂纹，胞外的溶剂容易进入细胞，溶解并释放细胞内物质，从而有效提高提取效率。（5）酶法。纤维素酶能够破坏以纤维素为主的细胞壁结构及细胞间的果胶，使植物中果胶完全溶解成小分子物质，减小提取中的阻力，充分释放胞内物质。该法简便快捷，提取率高。

氯仿试剂萃取法是纯化蛇足石杉中的生物碱的传统方法。生物碱在中性或酸性溶液中以正离子形式存在，用阳离子交换树脂吸附和富集，再进行洗脱，可以达到分离纯化目的。查圣华等[11-13]采用大孔树脂固相萃取法来纯化Hup-A和Hup-B。而李俊等[11]则采用阳离子交换树脂法来分离纯化Hup-A，在不同型号的树脂中C004树脂的吸附和解吸效果最好。

蛇足石杉生物碱含量测定主要利用高效液相色谱法（HPLC）。孙远明等[12]采用该法测得蛇足石杉中Hup-A的含量约为0.2‰，明显高于高效薄层扫描法测得的结果（0.066‰）[13]。

2.2 三萜化合物的提取分离

提取分离蛇足石杉三萜类化合物的方法主要有以下几种：（1）乙醇提取法[14]。用蛇足石杉全草，经95%乙醇提取，提取物用5%HCl溶液和乙醚分离。乙醚提取物依次用石油醚和二氯甲烷抽提。石油醚部分经硅胶柱层析，分离出serratenediol-21-acetate、21-episerratenediol-3-acetate、serratenediol-3-acetate3种三萜化合物。二氯甲烷部分也经硅胶柱层析，分离得到21-episerratenediol、serratenediol、16-oxodiepiserratenediol3种三萜化合物。（2）酒石酸法[9]。将蛇足石杉全草粉末在2%的酒石酸水溶液里提取6次，获得酸提取物。饱和碳酸氢钠溶液将其碱化至pH=10，用氯仿萃取分离，经硅胶柱层析和重结晶得serratenediol、21-epi-serratenediol和serratenediol-3-acetate3种三萜化合物。

2.3 黄酮类化合物的提取与纯化

蛇足石杉黄酮类化合物提取的方法有以下几种。（1）微波提取法。利用磁控管所产生的超高频率震动，使材料内分子相互碰撞、挤压，利于有效成分的浸出。此法反应高效、选择性强、操作简单、副产物少、产率高、产物易提纯。余红英等[15]证实该方法最佳提取条件为辐射时间30 s，微波功率650 W，乙醇浓度90%，料液比1∶50（W/V），总黄酮提取率可达16.651 mg·g-1。（2）有机溶剂提取法。根据黄酮类化合物与杂质极性不同来选择适合的有机溶剂，如用60%乙醇提取蛇足石杉总黄酮，提取率可达1.262 6%。

依据蛇足石杉黄酮类化合物结构上的酚羟基及其还原性羰基能够与金属盐试剂形成有色络合物的原理，常用分光光度法测定黄酮类化合物的含量，该方法简便、快捷、准确。

3 蛇足石杉的主要药理作用

临床上，蛇足石杉可用于治疗阿尔茨海默病（AD）、血管性痴呆、记忆障碍、小儿智力发育迟缓、重症肌无力、脑卒中后的尿失禁等疾病，其中最具药用价值的有效成分为Hup-A。Hup-A又名福定碱，商品名为双益平、哈伯因。药理研究显示，它是一种同时具有纯天然性、高选择性及可逆性抑制中枢AChE药剂，与他克林（Tacrine）、多奈哌齐（Donepezil）、利斯的明（Rivastigmine）及加兰他敏（Galantamine）4种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的胆碱酯酶抑制剂作比较，具有作用时间久、口服生物效率高、易穿过血脑屏障、副作用小等特点，是治疗AD的特效药剂[16]。

3.1 抑制乙酰胆碱酯酶作用

1986年，王月娥等[17]首次报道从蛇足石杉提取的Hup-A对胆酰酯酶活力有抑制作用，且对AChE的抑制作用可逆。Hup-A能与AChE的Tyr337形成结合速度快而解离速度慢且亲和力强的AChE-Hup-A复合物，此位点仅在哺乳动物中发现。Hup-A依靠这种独特的结合方式高效选择性地抑制哺乳动物的AChE[18]。Hup-A具有比其它同类抑制AChE药剂更持久性的特点，由于其可产生一种独特的连接Gly117和Gly118的具有挡板作用的肽键（仅通过连接Hup-A而介导）。

3.2 对抗毒性作用

有机磷化合物具有不可逆抑制中枢和外周的AChE作用，是一类对神经系统有剧烈伤害性的毒剂。Hup-A通过与AChE可逆的结合阻断其与有机磷不可逆的结合而对抗有机磷中毒。通过穿过血脑屏障到达大脑的途径，Hup-A能达到切断AChE与有机磷不可逆的结合作用。有研究称，血浆中可能存在内源性有机磷清除剂，是丁酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的可能性较大。丁酰胆碱酯酶与AChE差异甚微，Hup-A仍能选择性抑制血浆红细胞中AChE，而无抑制丁酰胆碱酯酶作用。Hup-A这种高选择性且对有机磷中毒有预防的作用，显示其在预防化学武器方面的潜在价值[19]。

Hup-A还具有抑制谷氨酸盐毒性功效。谷氨酸盐可造成钙离子向细胞内流，使细胞内钙离子浓度过高而致死。Hup-A对抗谷氨酸盐中毒机制可能是阻断信号向通路下游的传递，也可能是由于有谷氨酸受体介导的参与[20]。研究发现：Hup-A对NO供体导致人神经细胞瘤SK-N-SH系细胞的生长有抑制作用，并诱导凋亡；Hup-A不仅能抑制小鼠胶质细胞NO的产生，也能抑制人和鼠星形胶质细胞NO的产生[21]。

β-淀粉样肽（Aβ）的神经毒性作用使氧自由基增加，导致损伤神经细胞膜和线粒体DNA而致使AD病发[22]。Hup-A通过提高抗氧化酶活力来对抗Aβ产生的毒性。研究发现，添加Hup-A的实验组降低了Aβ所导致的毒性，同时细胞存活率及抗氧化酶活力明显提升，丙二醛水平下降。

4 蛇足石杉有效成分的基因工程研究

蛇足石杉由于生存环境的特殊性造成其生长缓慢，周期长。目前该资源处于濒临灭绝的状态，由于所含Hup-A具有的显著药理作用而导致巨大的市场效益，故野生蛇足石杉被人为大量采掘和破坏。庞大的市场需求使得自然生长的蛇足石杉远远不能满足。一些学者尝试寻求新途径获取蛇足石杉有效成分，但植物组织培养技术难度大，易染菌，成活率低；化学合成技术成本高，临床效果差。解决资源短缺和实现新途径生产蛇足石杉有效成分，基因工程成为提高蛇足石杉有效成分产量的有效途径之一。

4.1 Hup-A生物合成途径关键酶的克隆

研究表明，Hup-A的生物合成是以赖氨酸脱羧酶（Lysine decarboxylase，LDC）介导赖氨酸脱羧开始，再由铜氨氧化酶（Copper amine oxidase，CAO）催化尸胺生成四氢吡啶（2，3，4，5-Tetrahydropyridine），最后经过一系列酶促反应生成Hup-A[23-24]。

参与Hup-A生物合成的第一个酶是LDC，杜次等从蛇足石杉克隆获得2个赖氨酸脱羧酶基因LDC1和LDC2，两基因同源性高达95%[25]。与野芭蕉、玉米、拟南芥等高等植物LDC蛋白氨基酸序列的比对和分析显示，蛇足石杉LDC蛋白的氨基酸序列与它们具有较高同源性。通过预测其二级结构及构建三维结构模型，发现LDC1与LDC2有相同的生物活性。而证明LDC1与LDC2具有催化赖氨酸脱羧生成尸胺的生物活性可通过重组赖氨酸脱羧酶的活性实验来实现。

Sun等[26]从蛇足石杉中克隆得到铜氨氧化酶基因HsCAO，它能够通过大肠杆菌中的异源表达，并且催化尸胺生成四氢吡啶。它是Hup-A的生物合成途径中的第2个酶。与其它物种的氨基酸序列的比对和分析发现，其氨基酸序列与已知物种的氨基酸序列达到44%～56%的相似度，也存在CAO蛋白特有的Asn-Tyr-Asp/Glu活性位点。通过分子遗传进化分析亲缘关系发现，与小立碗藓在亲缘上具有较近关系，与植物起源进化关系相一致。

Ⅲ型聚酮合酶（Type Ⅲ polyketide syhthases，PKSs）中的查尔酮合酶超家族（CHS superfamily）能催化产生如生物碱、类黄酮等植物次生代谢产物。张萍[27]克隆蛇足石杉中的Ⅲ型聚酮合酶（查尔酮合酶超家族）基因HsPKS1与HsPKS2，其氨基酸序列与其它植物同源性可达到44%～66%。生物信息学分析发现，HsPKS1与HsPKS2基因编码的蛋白具有PKSs典型的催化活性中心—Cys-His-Asn。

4.2 萜类生物合成途径关键酶的克隆

蛇足石杉中萜类化合物分为胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径和质体中的1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸/2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（DXP/MEP）途径合成的。

殷秀梅[28]，罗红梅等[29]克隆了蛇足石杉MVA途径中的法呢基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophosphate synthase，FPS）基因HsFPS1、鲨烯合酶（Squalene synthase，SQS）HsSQS1、鲨烯环氧酶（Squalene epoxidase，SE）HsSE1和环阿屯醇合成酶（Cycloartenol synthase，CAS）基因HsCAS1，并运用生物信息学法对这些基因进行了分析和预测。氨基酸序列同源性比对数据表明，HsFPS1、HsSQS1、HsSE1、HsCAS1蛋白的氨基酸序列与其他物种中这些蛋白的氨基酸序列具有较高相似性，在蛇足石杉的根、茎和叶均有表达。其中，在茎中HsSE1基因的表达量最高，而在根中其他3个基因表达量最高。

罗红梅等[30]克隆蛇足石杉DXP/MEP途径中的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）基因HsDXR1。通过生物信息学分析发现，HsDXR1的蛋白具有DXR蛋白的特有保守结构域及酶结合的活性位点。实时荧光定量试验显示，HsDXR1蛋白在蛇足石杉茎中的表达量最高。

5 结论及展望

蛇足石杉作为一种古老的蕨类植物，具有悠久的药用历史。随着蛇足石杉药用有效成分不断被提取分离出来，有效成分合成途径的研究受到了越来越多的关注。目前，研究有效成分的合成途径主要利用分子生物学手段，这预示着不久的将来其生物合成途径和分子作用机制将全面被解释清楚，蛇足石杉在基因工程领域的研究及其药用有效成分的利用也将获得全面的发展。

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