农杆菌介导的西瓜枯萎病菌遗传转化

材料，以根癌农杆菌AGL1为介导，将带有gfp基因TDNA片段整合到西瓜枯萎病菌1号生理小种中，以期获得携带GFP标记的西瓜枯萎病菌转化子，为观察病原菌在西瓜抗、感寄主根系中的侵染过程提供工具，同时为揭示西瓜与枯萎病菌的互作和致病机理奠定基础。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病原材料

西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）1号生理小种（FON1），为本实验室鉴定并保存。

1.1.2根癌农杆菌的来源

Agrobacterium tumefaciens AGL1（带有pCHsGFP质粒）由中国农业科学院蔬菜花卉研究所谢丙炎研究员惠赠，sGFP在来源于Cochliobolus heterostrophus的glyceraldehydes3phosphate dehydrogenase基因启动子下，筛选标记hygromycin B phosphotransferase基因（hph）在Aspergillus nidulans trpC启动子下（图1）。

1.1.3植物材料

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.） Matsum. & Nakai]枯萎病的鉴别寄主材料‘Black Diamond’（感病，S），‘Sugar Baby’（感病，S），‘Crimson Sweet’（中抗，M），‘Charleston’（中抗，M），‘Calhoun Gray’（抗病，R），‘PI296341FR’（抗病，R），用于对转化株进行致病力鉴定。

1.2方法

1.2.1根癌农杆菌及西瓜枯萎病菌1号生理小种（FON1）菌液的准备

1.2.1.1根癌农杆菌的活化

取-80 ℃保存带有pCHsGFP质粒的AGL1号农杆菌在YEB培养基上画线培养，挑取单菌落于液体MM培养基中，摇培20～24 h（28 ℃、200 r/min）。离心集菌，将所集菌混到 IM液体培养基，（调节A600至0.18～0.22），摇培约6 h，使A600达到0.3～0.45。

1.2.1.2西瓜枯萎病菌孢子悬浮液的制备

将培养于PDA培养基中的枯萎病菌接种于PL培养基中，置于28 ℃恒温摇床中，125 r/min培养5 d后即可使用，用血球计数板计数，调整孢子浓度为5×106个/mL。

1.2.2不同转化条件对转化效率的影响

枯萎病菌孢子和经诱导后的农杆菌AGL1不同比例的筛选：枯萎病菌孢子悬浮液5×106个/mL和经诱导后的农杆菌AGL1按1∶1、2∶1、1∶2三个比例混合，分别取400 μL混合液均匀地涂到铺有灭菌滤纸条的共培养平板上，每个比例涂4个板，28 ℃下避光共培养36 h。将滤纸条揭下，反铺到含hygB（50 μg/mL）和头孢霉素（200 μg/mL）的选择培养基（PDA培养基）上，28 ℃培养2～3 d。揭下滤纸条，在28 ℃培养1～3 d，每天检查是否有新的抗hygB的单菌落出现。挑取选择培养基上能抗hygB的单菌落至二筛板（含hygB的PDA培养基）上进一步筛选验证。

共培养时间筛选：枯萎病菌孢子悬浮液5×106个/mL和经诱导后的农杆菌AGL1按1∶1比例的混合菌液共培养时间分别设置为24、36、48、60 h，其他同上，最后分别进行转化效率的计算分析。

1.2.3用荧光显微镜观察菌丝和分生孢子的荧光表型

将尖孢镰刀菌西瓜专化型转化菌株转接到添加hygB的PDA培养基平板上，观察生长情况。同时通过荧光显微镜观察菌丝和分生孢子的荧光强度。

1.2.4对转化子的抗病性鉴定

6个西瓜枯萎病的鉴别寄主材料种子用1.5%次氯酸钠溶液消毒20 min，常规浸种和催芽。

接种：将西瓜枯萎病菌1号生理小种及其转化菌株配制成浓度为5×106个/mL 的孢子悬浮液，西瓜播种8～10 d后待子叶展平时进行接种，采用浸根法接种15 min，每个野生菌株及其转化菌株接种30株，以无菌水接种为空白对照。接种后在温室26～30 ℃条件下培养，记录发病情况。

发病率（%）= 萎蔫株数/调查株数×100[18]。

2结果与分析

2.1共培养条件对转化效率的影响

2.1.1枯萎病菌孢子悬浮液和农杆菌AGL1比例对转化效率的影响

由图2可知，在共培养时间为36 h，枯萎病菌孢子悬浮液和诱导后的农杆菌AGL1比例为1∶2、2∶1时的转化效率分别为74.67、42.00个转化子/107个孢子，但当其比例为1∶1时，转化效率达到117.33个转化子/107个孢子，极显著高于其他比例处理。

2.1.2共培养时间对转化效率的影响

在枯萎病菌孢子悬浮液和农杆菌AGL1比例为1∶1的条件下，共培养24、48、60 h的转化效率分别为30.67、72.67、17.33个转化子/107个孢子（图3）。而共培养36 h的转化效率为117.33个转化子/107个孢子，极显著高于其他共培养时间下的转化效率，表明将西瓜枯萎病菌分生孢子与农杆菌AGL1共培养36 h转化效率最高。

图3共培养时间对转化效率的影响

Fig.3Effects of cocultivation time on transformation efficiency

2.1.3共培养条件

由以上两个条件的筛选可知，当孢子和诱导后农杆菌AGL1比例为1∶1，共培养时间为36 h时，转化效率高，当同时满足这两个条件时，转化效率达到最高，为117.33个转化子/107个孢子。

2.2转化子的荧光检测

按前面叙述的方法，共获得西瓜枯萎病菌转化株352个，随机挑选出10个进行荧光观察，其转化株4号荧光表型如图4，转化子所有菌体包括菌丝（图4a）、分生孢子（图4b）、孢子萌发的芽管（图4c）、继代培养后的菌体都有稳定而强的荧光信号，但在细胞质中的液泡无荧光信号（图4d）。结果表明gfp在西瓜枯萎病菌的转化株中得到了稳定而持续的表达。选择菌丝、分生孢子荧光信号表达稳定而强的转化子5个，进行下一步研究。

2.3转化子的致病力检测

对从2.2转化子的荧光检测中筛选出的5个转化株，通过人工接种，在无菌的条件下进行致病力的检测，由表1可见，其中4号转化子在不同品种上的致病力分别为85.67、93.00、67.67、52.33、10.00、5.00，与转化前的FON1在西瓜抗、感鉴别寄主上的表现无明显差异，将该菌株命名为FON1sGFP，说明GFP的转化和表达对枯萎病菌4号转化子的致病力无明显影响。

图4绿色荧光蛋白在西瓜枯萎病菌转化子中的表达

Fig.4Expression of green fluorescent protein in transformants of watermelon Fusarium oxysporum f.sp. niveum

表1FON1及转化子在西瓜抗、感寄主上致病力鉴定1）

Table 1Incidence of resistant and susceptible watermelon cultivars inoculated with transformants

转化子Transformants黑宝石Black Diamond（S）蜜宝Sugar Baby（S）红甜Crimson Sweet（M）查尔斯顿Charleston（M）卡红Calhoun Gray（R）PI296341FR（R）

FON1（87.67±0.65）bc（89.67±1.81）a（71.00±1.63）b（46.00±5.86）bc（8.00±1.96）bc（5.00±0.31）c

1（91.67±1.02）a（55.67±2.01）d（41.33±2.45）e（57.67±4.41）a（4.67±1.56）c（0.04±0.00）d

2（81.00±0.81）d（65.00±2.31）c（43.67±2.43）d（40.00±3.87）c（0.00±1.88）d（0.00±0.00）d

3（90.33±1.92）b（81.33±4.20）b（53.00±2.79）c（47.00±4.55）b（15.00±2.87）a（9.00±0.45）a

4（85.67±1.26）c（93.00±2.29）a（67.67±3.12）b（52.33±1.73）b（10.00±1.38）b（5.00±0.38）c

5（86.33±2.30）c（91.67±4.08）a（83.00±4.57）a（57.00±5.22）a（17.33±2.86）a（8.00±0.56）b

1） 同一列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

3小结与讨论

本试验是在参考前人关于根癌农杆菌介导的真菌转化方法的基础上进行的[1216，19]，成功地将 gfp 基因转化到西瓜枯萎病菌1号生理小种中，单孢继代培养多代后仍能够稳定遗传，且转化效率高，操作简单方便。

本研究最优良的转化条件为共培养时间36 h，枯萎病菌孢子的悬浮液和农杆菌AGL1比例为1∶1，转化效率可以达到117.33个转化子/107个孢子。这与其他病菌的转化条件不太相同，在玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）的转化中，张娇等得出在20 ℃条件下与根癌农杆菌共培养48 h，共培养介质为微孔滤膜时转化效果最佳[19]。香蕉枯萎病菌1号生理小种（F.oxysporum f.sp. cubense race 1）遗传转化体系的最优转化体系是农杆菌A600为0.15，共培养时间为48 h[15]。甜瓜蔓枯病的最优转化体系为农杆菌悬浮液A600为0.15，共培养时间与香蕉枯萎病菌一致，病菌的分生孢子悬浮液浓度为1×106个孢子/mL[16]。Mullins[12]对尖孢镰刀菌的农杆菌转化的研究中表明，影响转化效率的因素主要有两个，一是共培养之前在培养基中加入乙酰丁香酮（AS）；二是共培养时间，在培养基中加入AS，共培养时间为48 h 时，转化效率最高，达到300～500个转化子/106个孢子，远远高于本试验的转化效率，可能是因为载体的构成不同造成的。肖荣凤等[17]利用PEGCaCl2介导的原生质体转化体系，成功地将绿色荧光蛋白基因转入到西瓜尖孢镰刀菌FOV135中，每微克质粒可获得4～6个转化子，转化效率较低。说明遗传转化效率与转化条件、转化方法、载体的构成及病菌本身的遗传特性等都有关系。

对转化株进行荧光观察，发现转化子菌体的菌丝、分生孢子、孢子萌发的芽管、继代培养后的菌体都具有稳定而强的荧光信号，但在细胞质中的液泡却无荧光信号，在荧光显微镜下呈暗黑色。在番茄的枯萎病菌[9]（F.oxysporum f.sp. radicislycopersici）和水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）[20]的gfp转化株中发现了同样现象。本试验获得的带gfp的西瓜枯萎病菌的转化株，可以用来观察病菌在寄主根系内的侵染过程，为进一步揭示西瓜与枯萎病菌的互作和致病机理提供了工具。

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