超高静压在琥珀酸生产菌株选育中的应用

摘要： 伴随着经济的发展，生活水平不断提高，人们对生产菌株的要求越来越高。为了满足市场的需求，以现代科技为出发点，利用超高静压技术，不仅提高了生产效率，还有效地保障了生产后菌株的质量，是现代菌株选育的最佳选择之一。笔者从琥珀酸的结构特征着手，对超高静压在琥珀酸生产菌株选育中的应用作了简要分析。

Abstract： With the development of the economic， the standard of living has continuously improved and people"s requirements of the bacterial strain production are higher and higher. In order to meet the requirements of the market， the ultra-high static pressure technology with modern science is one of the best ways of the seed selection of the modern bacterial strain. It can improve the production efficiency and effectively guarantee the quality of the production strain. The author analyses the application of the ultra-high static pressure in the seed selection of bacterial strain production by succinic acid from the architectural feature of the succinic acid.

关键词： 超高静压；琥珀酸；菌株；选育；应用

Key words： ultra-high static pressure；succinic acid；bacterial strain；seed selection；application

中图分类号：Q935 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2014）32-0312-02

0 引言

超高静压技术与其他琥珀酸生产菌株选育相比具有明显的优势，这种技术不仅可以杀死微生物，还能提高菌株的生长率。目前，我国已经投入较大力度对超高静压技术进行研究，在不断探索发展过程中已经取得较大成就，但是，这种技术在实际中的应用具有较大的局限性，过多地应用于食品科技领域，主要用于杀菌和事物加工处理。为了扩大超高静压技术的使用范围，研究人员应该努力研究，促进该技术向其他领域发展。超高静压技术在琥珀酸生产菌株选育中的应用就是长时间研究的结果，并取得良好的效益，为该技术在其他领域的发展提供了保障。

1 琥珀酸的结构特征

琥珀酸也被称之为丁二酸，由于该物质最早从琥珀中分离出来，因此取名为琥珀酸。琥珀酸属于四碳二羧酸，相对分子质量为119.12，其分子结构式如图1所示。人和动物体内也存有大量琥珀酸，主要分布在血液和肌肉等位置，琥珀酸也是微生物新陈代谢的产物。琥珀酸属于天然有机酸的行列，是一种没有颜色的结晶体、微酸、属于易燃品。如果琥珀酸纯度非常高，那么，它将具有无臭、极酸的特点。在常温下，琥珀酸的相对密度为1.67，熔点最高可以达到188°C，其主要形态有α和β两种，以137°C，为标准，温度在这个标准以下，α型晶体性能稳定，温度在标准以上，β型晶体性能稳定。琥珀酸升华后形成丁二酸酐，琥珀酸还是一种极性有机酸，具有能溶于水、微溶于乙醇、不溶于苯、四录化碳等特点。最后，琥珀酸属于二氧羧酸的范畴，温度达到25°C左右时，两极分解的常数有严格规定，总之，琥珀酸的结构特性具有多种化学特性，如酯化反应、卤代反应以及氧化还原作用等。其中，酯化反应主要作用的对象是还原性糖，由于琥珀升华后会脱水，这个过程也会产生一定数量的单酯和双酯；卤代反应作用的对象是PCI3和PCI5，反应后生成琥珀酸酰氯；氧化还原反应中使用的氧化剂以二氧化氢为主，反应后产生过氧琥珀酸。

2 超高静压在琥珀酸生产菌株选育中的应用

2.1 材料与方法 菌种以琥珀酸放线杆菌A3为主；选用四种培养基：平板培养基、平板初筛培养基、种子培养基和发酵培养基，这四种培养基的配合比例有严格要求，必须按照配合标准进行严格配量。试验方法包括培养、诱变处理、筛选、超高静压诱变处理和发酵液中有机酸的测定方法五种，主要步骤如下介绍：①培养方法。平皿置放于厌氧培养箱内部，厌氧培养箱内含有N2、H2和CO2的混合气体，三者之间的混合比为8：1：1，厌氧培养箱内的气温控制在37°C左右，培养时间为12小时。利用种子进行培养，种子培养的温度为37°C左右，时间为2小时，种子培养8小时后，进行接种工作。②诱变处理方法。首先，对菌株进行预培养，发酵液要保持新鲜，将其置放于7000r每分钟冷冻离心20分钟后进行洗涤，洗涤液以生理盐水为主，产生菌悬液，将其放置于超高静压装置中进行诱变处理。③筛选方法。筛选分为初筛和复筛两步，初筛工作是保证筛选质量的基础保障，将诱变处理后的菌液进行稀释，待稀释浓度达到要求后，存放于厌氧培养箱中进行培养。复筛的主要对象是初筛中变色圈较大、生长速度快的单菌落，将其置放于血清瓶发酵培养基中进行培养，发酵结束后检测相关指标是否合格。④超高静压诱变处理。超高静压对菌株的生长率有直接影响，在标准的初始处理条件下，变压速度以瞬间变压为主，其中某个处理条件发生变化时，其他处理条件始终保持不变，超高静压诱变处理时压力达到最大时，就可以开始降压处理。

2.2 结果与讨论

2.2.1 超高静压对菌株死亡率的影响

2.2.1.1 压力大小对菌株死亡率的影响 菌株的种类有很多种，不同种类的菌株对同一大小的压力的敏感程度存在较大的差异，以100MPa到400MPa为标准范围，考察压力对菌株死亡率的影响。压力大小对不同生长期菌株死亡率的影响如下图2所示。从图2中可以看出，菌株致死率和压力的大小成正比，压力越高，菌株的致死率就越大。

2.2.1.2 变压速度对菌株死亡率的影响 考察过程中，变压速度以10MPa每分钟和50MPa每分钟为准，变压条件为瞬间变压。从应用考察中可以发现，不同变压速度对菌株的死亡率有直接影响，变压速度越慢，保压时间越长，菌株的致死率越高。相反，变压速度越快，菌株的致死率越低，因此，适当的缓和变压是提高菌株存活率的重要手段。

2.2.1.3 生长期对菌株死亡率的影响 通过研究表明，所受压力相同时，菌株的致死率比稳定期高。因此，本研究实验应该选择具有稳定性的菌株进行诱变实验。

2.2.2 突变株的筛选 结合上文中对超高静压对菌株死亡率的影响研究，应该选择合适的处理条件对琥珀酸放线杆菌A3进行处理，从上文中可以总结出，最佳的处理条件应该为200MPa压力和50MPa每分钟的升降速度。结果表明，在上述处理条件下进行琥珀放线杆菌A3处理后，菌株的平均死亡率在80%左右，正变率达到16%，正突变菌株的丁二酸产量平均提高了10%。

2.2.3 突变株的遗传稳定性 经过筛选选出4株高产正变突株，经过四次代传，考察代传对菌株产量的影响，四次代传结果如表1所示。

过诱变产生的正突变菌株经过四次代传后，突变株B19、B39以及B56具有较稳定的遗传特性，其中B19的生产能力叫其他种类而言高出很多，是最佳的突变株。

3 结束语

超高静压在琥珀酸生产菌株选育中具有不可代替的作用，利用超高静压，对琥珀酸放线杆菌A3进行选育，通过诱变，选择合适的选育品种。在实际应用过程中，对环境压力、变压速度、生长期对菌株存活率的影响等做了仔细研究，菌株的死亡率和正变率以及正突变菌株丁二酸产量都发生了较大变化。总之，超高静压是一种新性能的，具有操作简单、无污染以及成本投入低的微生物诱变育种技术，强化超高静压诱变机理的研究是相关行业发展的必然选择。

参考文献：

[1]张常青，苟冬梅，梅佳军等.进化代谢选育高渗透压耐受型产琥珀酸大肠杆菌[J].生物工程学报，2012.

[2]杨建刚.基于基元模式分析产琥珀酸大肠杆菌的构建[D].天津大学，2012.

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