纤维素酶活力测定方法研究进展

摘要纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-1，4-葡萄糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称，传统上将其分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶是一种复合酶，准确测定纤维素酶活力的大小，对于研究纤维素酶的特性及应用具有重要意义。该文对纤维素酶测定的常用方法进行了综述和评价。指出单一的酶活力测定方法不能确切的反映该酶的作用机制和活力，只有诸活力的综合测定方能全面的反映酶制剂对纤维素的作用。

关键词纤维素酶；活力测定；内切葡聚糖酶；外切葡聚糖酶；β-葡萄糖苷酶

中图分类号O636.1+1文献标识码A文章编号 1007-5739（2010）24-0032-03

ResearchProgressonMethodforDeterminationofCellulaseActivity

CHI Ya-qin 1HUANG Kui 2

（1 College of Conservation Biology，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224； 2 Jointown Pharmaceutical Group Limited liability Company）

AbstractCellulase is a general reference of enzymes that hydrolyzes β-1，4-glycosidic linkages in cellulase into glucose. Traditionally，it has been divided into three categories：endo-glucanase，exo-glucanase or cellobiohydrolase，and β-glucosidase. Cellulase is a complex enzyme composed of several components.It is important to accurately detect the activity of cellulase for study this enzyme.In this paper，the common method of determination of cellulose were reviewed and evaluated. The single method to determine enzyme activity cannot accurately reflect the function mechanism and activity of this enzyme. Only a comprehensive determination of all activity can fully reflec the role of enzymes on cellulose.

Key wordscellulase；determination of activity；endo-glucanase；exo-glucanase；β-glucosidase

纤维素属于一种线形葡聚糖天然高分子化合物，由葡萄糖分子通过β-1，4-糖苷键连接而成，基本重复单位是纤维二糖，残基间由β-1，4糖苷键连接，而纤维二糖由两分子β-D-吡喃型葡萄糖以β-1，4糖苷键连接形成，是地球上最丰富的生物聚合物[1-2]。在纤维素之间存在着氢键，通过氢键的缔合作用，纤维素链形成了纤维素束。在这个纤维素的连续结构中，分子密度大的地方，成平行排列，定向良好，形成纤维素的结晶区。随着致密度的变小，结合程度变弱，分子间空隙变大，定向变差，形成了纤维素的无定型区。在纤维素中，除了纤维素链之间存在氢键外，在分子内也存在有氢键。氢键是一种高能键，这种键的存在给纤维素水解带来很大的困难[3]。

纤维素酶（cellulase）是指能水解纤维素β-1，4-葡萄糖苷键，使纤维素变成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系，包括内切葡聚糖酶（EG或CX）、外切葡聚糖酶（CBH，EC或C1）和β-葡萄糖苷酶（CB，纤维二糖酶）[4-5]。由于各种纤维性材料中结晶区、无定形区所占比例不同以及其他物理性质的影响，完全降解时所需要的上述3类纤维素酶的比例也各异。同理，以各种纤维材料为底物测试同一种纤维素酶系并以还原糖的产生作标准时，得到的活力值也不同，这是测定纤维素酶活力时遇到的主要难题之一。所以在测定时，国内外研究者通常通过测定在一定时间内纤维素酶解的平均速率来表示纤维素酶的活力。纤维素酶酶活定义采用国际酶学委员会规定的国际单位U，即在特定条件下，每分钟催化底物产生1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位（U）[6]。该文从纤维素的降解机制出发，对国内外近几年内常用的纤维素酶测定方法进行了综述。

1纤维素的酶解机制

纤维素酶的3类组分对纤维素的确切酶解机制还未完全确定，当今学术界大致有3种假说：Reese等[7]提出的C1-CX假说、Enari等[8]提出的顺序作用假说、协同作用假说[9]。目前，普遍接受的纤维素酶的降解机制是协同作用模型，即C1酶破坏纤维素的结晶结构，作用于不溶性纤维表面，使纤维素结晶链开裂，长链纤维素分子末端部分游离和暴露，使纤维素易于水化，经C1酶作用后的纤维素分子结晶结构已经被破坏，Cx酶即吸附在纤维素分子上面，从键的内部任意位置切开β-1，4-糖苷键，将纤维素分子断裂为纤维二糖和纤维三糖等。最后这些被裂解产物纤维二糖、纤维三糖和其他低分子纤维糊精由β-葡聚糖苷酶分解为葡萄糖（图1）[10-11]。

2测定单一纤维素酶组分的活力

2.1内切葡聚糖酶（EG或CX）活力测定

内切葡聚糖酶作用于纤维素的非还原多聚体末端，随机水解β-1，4-糖苷键，每次切下1个纤维二糖分子，将天然纤维素分解为直链纤维素，使其转变成水合非结晶纤维素，产生大量的还原性末端。活性测定方法主要有还原糖法和粘度法。

2.1.1以还原糖的生成量表示CX酶活力。由于通过测定反应过程中还原糖的生成量（通常用葡萄糖含量做为标准）来间接衡量还原末端的增加，从而进一步计算相应的内切葡聚糖酶活力[6]。可以用磷酸膨胀纤维素、羧甲基纤维素或经乙基纤维素等无定形纤维素为底物，以还原糖的生成量表征酶活力，特别是羧甲基纤维素（CMC）价廉、易得而且应用最广，俗称CMCase或Cx酶活力[13-14]。

Ghose[15]所推荐的DNS法是在0.5 mL 2%CMC、0.05 mol/L柠檬酸缓冲液中，50 ℃反应30 min，加入的酶量以能够形成0.5 mg葡萄糖为标准，再用DNS定糖。现在有报道将这种方法做了一些改进，主要是在缓冲液和底物浓度方面。其测定的特点是：①测定底物为羧甲基纤维素，是可溶性的，因此，底物对酶呈饱和状态；②底物是可溶性的，使底物的加入量更为准确，过程也比较简单；③由于底物是羧甲基纤维素，没有结晶区，纤维素酶对其分解更加容易，大大提高了其测定的灵敏度；④测定所需要的时间为30 min，比滤纸酶活力法测定总酶活力所用的时间大大缩短，非常适于快速测定。此方法最主要的缺陷在于生成的还原糖混合物和葡萄糖标准曲线之间的化学计量关系较差[16]。

2.1.2粘度法测定CX酶活力。粘度法的依据是CX酶可利用纤维素分子内部的裂缝，通过微量的水解作用使可溶性纤维素衍生物的特定粘度显著减少，这是利用测定高分子溶液粘度从而导出其聚合度和分子量的方法来表征CX酶活力[17]。该方法的优点是可以测得初速度，较能代表该酶的作用。但是，此方法的缺点是受到灵敏度的限制，试验过程繁琐，难以操作，并且只能得到相对值。

2.2外切葡聚糖酶（CBH，EC或C1）活力测定

C1酶以纤维二糖为单位，作用于纤维素链的还原性和非还原性末端，有序水解纤维素长链，产生大量葡萄糖和带非还原性末端的小分子纤维寡糖。

Desphander等[18]以合成的P-nitrophony-β-D-cellulase（PNPC）为底物检查C1酶活力，其原理是C1酶能够特异性的水解对-硝基酚纤维二糖苷，产生纤维二糖和对-硝基酚。但是，β-葡萄糖苷酶可水解对-硝基酚环上键合的纤维二糖，而纤维产生菌总会生成β-葡萄糖苷酶。因此，需添加抑制剂，如D-葡萄糖酸、δ-内酯来限制β-葡萄糖苷酶的作用，这是应用中的一个不便。刘洁等[19]提出一种简易的C1酶测定方法，它是基于C1、CX和β-葡萄糖苷酶三组分在棉纤维上吸附和脱吸附能力的不同而设计的，不需要特定的底物。

微晶纤维素（Avicel）是用稀酸水解纤维材料使结晶区与非结晶区断裂后得到的聚合度降低、结晶度升高的产物，在不溶性纤维中的可及性末端数和易于被作用的β-1，4-糖苷键数比最高。因此，在作为底物通过还原糖法测定C1酶活力得到广泛应用[20]。但是，内切葡聚糖酶对Avicel的水解程度较高，对原酶液而言，它反映的是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用结果，对单一组分来说，它反映的实际上是某些内切葡聚糖酶组分活力。

2.3β-葡萄糖苷酶（CB，纤维二糖酶）活力测定

β-葡萄糖苷酶能将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。其活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-β-D-葡萄糖苷（pNPG）、纤维二糖、水杨苷等。从纤维素酶解机制上考虑，由于内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶均不能水解纤维二糖，所以应考虑以纤维二糖作为底物测定酶解后葡萄糖的生成量来表征β-葡萄糖苷酶的活力[21]。孙迎庆等[22]用多种方法测定β-葡萄糖苷酶活性，如以二糖或寡糖为底物，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶测定产生的葡萄糖量的方法来确定β-葡萄糖苷酶活性；用水杨苷为底物，将水杨苷裂解为水杨醇和葡萄糖，然后将酶解产物中的水杨醇用4-氨基安替吡啉作显色剂显色，用分光光度法在515 nm下比色测定β-葡萄糖苷酶活性。

在上述酶活力测定中大都用DNS法来测定还原糖的生成量，该法简易、灵敏度也可满足要求，研究工作中也有应用其他更灵敏方法的报告。由于在纤维材料水解中产生的是包括葡萄糖、纤维二糖及几种纤维寡糖的混合物，因此，以葡萄糖为标准反映出的还原糖生成量自然会因产生的产物成分比例不同，可以配合HPLC等分析方法进行准确测试。

3测定纤维素酶组分的总活力

3.1滤纸酶活

滤纸是聚合度和结晶度都居中等的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法得到广泛应用，它反映了3类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活（FPA）。

滤纸酶活力法测定总酶活力虽然是一种通用的、公认的、经典的方法，但由于其底物为滤纸是不溶性的，结构比较复杂，不同厂家生产的滤纸也不同，对试验结果有一定的影响。因此，对滤纸品种的要求也十分严格。在近来的总酶活力测定过程中发现，国产滤纸的质量有所变化，其本底值过高，给测定带来较大的误差，样品的活力不同，其灵敏度也不同[23-24]。

目前，由国际理论和应用化学联合会（IUPAC）创立和推广的以Whatman No. 1号滤纸（日本用东洋1号）作为底物的滤纸酶活测定法是测定纤维素酶组分总活力最普遍的方法[15]。该方法的优点是底物纯度高，操作简单，测定程序简便。然而，其结果的可靠性易受下列几个方面的影响：β-葡萄糖苷酶的含量、DNS试剂的新鲜程度、沸水浴的激烈程度、滤纸单位面积大小及滤纸切割方式。

3.2其他方法

纤维素的溶解活力是高培基根据纤维素酶系的三组分在对CF-11纤维素粉的溶解和还原糖生成时作用的不同，提出了一个同时测定一个纤维素酶系溶解活力和糖化活力的方法[25]。

对短纤维形成因子的测定是Wood[26]根据棉纤维等在真菌纤维素酶作用下酶解早期有大量短纤维形成的现象，提出酶组分有催化短纤维形成的作用，并以分级浊度法进行测定，对研究纤维素酶的作用机制有较大帮助。

Wood等在研究纤维素酶作用时，观察到棉纤维材料在一些化学试剂（NaOH、NH4OH等）的作用下，纤维素的链间和链内氢键断裂，吸湿性增强。用棉纤维在18%NaOH（W/V）中吸收NaOH的能力作为测定纤维膨胀因子的方法，以反映纤维素酶对纤维素结构的作用。

4总结

纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油、勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸和生物能源等工业应用上具有重要地位。市售纤维素酶中除纤维素酶组分外，还有半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等糖苷水解酶类。因此，在各种应用及研究方面，精确测定一个酶制剂的纤维素酶活力是比较重要的。

在实际测定中，测定的结果与所采用的各项测定条件有关，采用不同的测定条件，会得出不同的结果。纤维素酶测定的难度大，一是底物的复杂性，二是各酶之间的协同作用，三是在于形成各种终产物的反馈抑制作用。若欲对酶制剂的特性有全面的认识，只用1种底物或1种方法，在一定条件下反应一段时间，从而计算酶活力的结果是不完全可靠的。因此，在对纤维素酶活力及性质进行描述时，必须清楚注明测定条件中所有参数，不同研究所获得的结果进行比较时，应避免与采用不同底物、不同条件或不同测定方法所得的结果进行比较。同时，还应在测定过程中对所用方法和测定条件进行严格限定，力求准确、全面地反映纤维素酶的性质及作用机制。

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