高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇的含量

摘要：采用高效液相色谱法测定了虎杖不同生长条件及不同部位的白藜芦醇含量。建立了以色谱柱为Ｚｏｒｂａｘ ＣＢ－Ｃ１８（４．６×２５０ ｍｍ，５ μｍ），流动相为甲醇－水（３５∶６５，Ｖ／Ｖ），流速为０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为３０６ ｎｍ，柱温为室温，进样量为８０ μＬ的高效液相色谱方法。结果表明，白藜芦醇浓度在２～１００ μｇ／ｍＬ范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（ｒ＝０．９９９ ９）；平均回收率为９９．１％，ＲＳＤ＝１．２％（ｎ＝６）。野生虎杖和组织培养虎杖白藜芦醇含量存在较大差异，虎杖不同部位白藜芦醇含量也存在较大差异，其中以野生虎杖根中白藜芦醇含量最高。虽然在不同培养条件下，虎杖的不同部位都含有白藜芦醇，但与野生虎杖根相比含量差距较大，不能代替野生虎杖根的药用价值。

关键词：虎杖；白藜芦醇；高效液相色谱法

中图分类号：Ｏ６５７．７＋２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）04－0825-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｉｎ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｂｙ ＨＰＬＣ

ＸＩＡ Ｈａｉ－ｗｕ，ＴＡＮ Ｚｈｉ－ｊｉｎｇ，ＭＩＡＯ Ｙｏｎｇ－ｍｅｉ，ＤＥＮＧ Ｄｕｎ

（Ａｎｈｕｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｆｅｎｇｙａｎｇ ２３３１００， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｗｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｒｔ ｏｆ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ． Ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ Ｚｏｒｂａｘ ＣＢ－Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ （２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ， ５ μｍ） ｉｎ ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｗａｔｅｒ （Ｖ／Ｖ＝３５／６５）ｗｉｔｈ the ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ３０６ ｎｍ ｉｎ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｆｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔing ８０ μＬ ｓａｍｐｌｅ． Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｗａｓ ２～１００ μｇ／ｍＬ ｗｉｔｈ an ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ９９．１％ （ＲＳＤ＝１．２％，ｎ＝６）． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ in ｗｉｌｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｒｔｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ａｌｓｏ ｖａｒｉｅｄ． Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｉｎ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ in wild plants． Ｔｈｏｕｇｈ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｄｉｆｆｅｒｅd ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ content was detected ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｗｉｌｄ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ， ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｗｉｌｄ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｗａｓ ｉｒｒｅｐｌａｃｅａｂｌｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ； ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ； ＨＰＬＣ

白藜芦醇（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）又称芪三酚，现代药理研究证明：白藜芦醇具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、抗自由基、保护肝脏、保护心血管和抗心肌缺血、免疫调节、降血糖、降血脂等作用［１，２］。另外白藜芦醇还有抗衰老、皮肤保健和美容功效［３，４］。朱鸿津采用ＨＰＬＣ法测定虎杖（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ Ｓｉｅｂ．ｅｔ Ｚｕｃｃ．）中白藜芦醇含量，测定结果表明，虎杖根中白藜芦醇含量可高达千分之一，可作为白藜芦醇的提取原料［５］。然而，由于虎杖根的野生资源有限，大量采挖使野生资源日趋减少，近年来有一些利用组织培养快速繁殖虎杖的报道。文涛等［6］测定发现虎杖愈伤组织中也含有白藜芦醇，并对虎杖不同部位白藜芦醇含量进行分析，结果发现虎杖根、茎、叶中均含有白藜芦醇，其中多年生根中含量最高［７］。综上所述，虎杖不同生长条件、不同部位均含有白藜芦醇。准确测定虎杖不同生长条件及不同部位白藜芦醇含量，将为虎杖资源进一步开发利用提供参考。

１材料与方法

１．１仪器与材料

高效液相色谱仪检测站（含Ｗａｔｅｒｓ １５２５二元泵、Ｗａｔｅｒｓ ２４８７双通道紫外检测器、Ｂｒｅｅｚｅ分析软件）（美国，沃特斯公司）；Ｚｏｒｂａｘ ＣＢ－Ｃ１８（４．６×２５０ ｍｍ，５ μｍ）色谱柱（美国，安捷伦公司）；Ｇｚｘ－９１４６ ＭＢＥ数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；ＴＧＬ－１６Ｇ台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；Ｗ２０１Ｄ恒温水浴锅、申科Ｒ－２０５旋转蒸发器（上海申顺生物科技有限公司）；ＳＨＢ－Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州市上街华科仪器厂）；ＦＡ２００４Ｎ电子分析天平（上海精科天平仪器厂）；ＪＬ－３６０ＤＴ型金利牌超声波清洗器（上海杰理科技有限公司）。

野生虎杖于２００７年１１月份采集于安徽科技学院中药种植园，由中药教研室时维静教授鉴定，为蓼科植物虎杖（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ Ｓｉｅｂ．ｅｔ Ｚｕｃｃ．）；虎杖组织培养苗由安徽科技学院生物工程实验室提供，是由野生虎杖经组织培养而来。白藜芦醇标准品（Ｓｉｇｍａ公司，纯度９９．９％）；乙酸乙酯（天津市北方天医化学试剂厂，分析纯）；甲醇（ＴＥＤＩＡ公司，色谱纯）；去离子水；其余试剂均为分析纯。

１．２虎杖白藜芦醇的提取

把待测虎杖于５０ ℃干燥箱内过夜烘干，准确称取１．０００ ｇ样品，加１ ｇ石英砂，于研钵中研碎，加１０ ｍＬ乙酸乙酯，倒入５０ ｍＬ具塞三角烧瓶中，再加１０ ｍＬ乙酸乙酯冲洗研钵，一并倒入三角烧瓶中，室温避光提取１２ ｈ；然后将提取液以１ ０００ r／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清于棕色试剂瓶中保存，残渣加１５ ｍＬ乙酸乙酯继续提取１２ ｈ（共提取３次）。将３次提取液与去离子水以１∶１（V/V）混合，抽提３０ ｍｉｎ，以

１ ０００ r／ｍｉｎ室温离心１５ ｍｉｎ，取有机相。将提取液于５０ ℃、８０ r／ｍｉｎ旋转减压挥干。用色谱纯甲醇９ ｍＬ洗涤干燥瓶，倒入１０ ｍＬ容量瓶中，用色谱纯甲醇定容至１０ ｍＬ，再转入棕色试剂瓶中，待测。

１．３色谱分析条件

流动相：甲醇－水（Ｖ／Ｖ＝３５／６５）；流速：０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；测定波长：３０６ ｎｍ；柱温：室温。

１．４标准溶液的配制

准确称取白藜芦醇标准品１０．０ ｍｇ，用色谱纯甲醇定容至１０ ｍＬ，配制得１．０ ｍｇ／ｍＬ标准白藜芦醇溶液，然后依次稀释为１００ μｇ／ｍＬ、３３．３ μｇ／ｍＬ、２０ μｇ／ｍＬ、１２．５ μｇ／ｍＬ和２ μｇ／ｍＬ等５个不同浓度的工作溶液，待测。

２结果与分析

２．１标准曲线的绘制

将上述５个不同浓度的标准白藜芦醇溶液用０．４５ μｍ滤膜过滤。对过滤后的流动相进行超声脱气１０～２０ ｍｉｎ，依次进样，每次进样８０ μＬ。以标准品不同浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

由图１获得回归方程为：ｙ＝２０ ０００ ０００ｘ-２２ ３４３，其中Ｒ２＝０．９９９ ９。

２．２精密度试验

按上述色谱条件，精密吸取质量浓度为２０ μｇ／ｍＬ的对照品溶液，重复进样６次，每次８０ μＬ，根据对照品峰面积积分值，计算ＲＳＤ为１．３５％（ｎ＝６）。

２．３ＨＰＬＣ法测定白藜芦醇含量

用０．４５ μｍ滤膜过滤样品。对过滤后的流动相进行超声脱气１０～２０ ｍｉｎ。依次进样，进样量为８０ μＬ，测定结果见图３和表１。

图３为野生虎杖茎（即表１中的Ａ１Ｂ３）白藜芦醇含量色谱图。根据白藜芦醇标准品曲线的回归方程ｙ＝２０ ０００ ０００ｘ-２２ ３４３，按外标峰面积法求得各样品的白藜芦醇含量。实验测得的数据有两个影响因素，生长条件（Ａ）和部位（Ｂ），即Ａ因素有２个水平，Ｂ因素有３个水平，共有６个组合，每一组合有３个检测值，则一共有１８个检测值。测定结果见表１。

２．４资料的方差分析

将表１资料用ＳＰＳＳ １３．０软件作方差分析，以固定模型作Ｆ测验。

由表２可知，生长条件的Ｆ＝３１．２２６，Ｐ＜０．０１，部位的Ｆ＝４１．５４７，Ｐ＜０．０１，生长条件与部位互作的Ｆ＝３１．７４３，Ｐ＜０．０１，表明生长条件、部位及生长条件与部位互作虎杖中白藜芦醇含量均有极显著差异，即虎杖在不同生长条件下，白藜芦醇含量存在极显著的差异；虎杖不同部位白藜芦醇含量存在着极显著的差异；虎杖不同生长条件及不同部位白藜芦醇含量存在着极显著的差异。

３小结与讨论

从测定结果看，野生和组织培养虎杖不同部位白藜芦醇含量差异很大，经方差分析表明有极显著差异。就部位而言，根部白藜芦醇含量显著高于叶和茎的白藜芦醇含量，而茎和叶白藜芦醇含量则无显著差异，这与张烜等研究的ＨＰＬＣ法测定花生不同部位白藜芦醇含量中花生根部白藜芦醇含量最高相符［８］。所有样品中白藜芦醇含量最高的是野生根，野生根中白藜芦醇含量高达０．６９６ １ ｍｇ／ｇ。这主要因为虎杖是多年生草本植物，在其根部积累的白藜芦醇含量较高，这与传统的药用部位相符，而野生的叶和野生茎都是１年生，组织培养虎杖培养时间为１个月左右，所以虎杖中白藜芦醇含量较低。另一方面，野生的生长条件对白藜芦醇的合成创造了良好的逆境条件。

利用组织培养手段获得的虎杖无菌组培苗虽然具有繁殖率高、生长速度快等优点［９］，但由于生长条件相对单一而稳定，导致“逆境物质”白藜芦醇合成能力下降。在虎杖组织培养时，我们可以从人工创造有利于白藜芦醇合成的生长条件方面研究，如调节光照、温度等条件，以提高虎杖中白藜芦醇含量。

参考文献：

［１］ 李旭波，谢人明． 白藜芦醇的药理作用研究进展［Ｊ］． 西部药学，２００７，４（１）：３７－３９．

［２］ 郜海燕，于震宇，陈杭君，等． 白藜芦醇功能和作用机理研究进展［Ｊ］． 中国食品学报，２００６，６（１）：４１１－４１６．

［３］ 韩晶晶，刘炜，毕玉平． 白黎芦醇的研究进展［Ｊ］． 生物工程学报，２００８，２４（１１）：１８５１－１８５９．

［４］ 李延华，王伟君，张兰威，等． 白藜芦醇的研究现状及应用前景［Ｊ］． 中国酿造，２００８，１８４（７）：１０－１２．

［５］ 朱鸿津． ＨＰＬＣ法测定虎杖中白藜芦醇含量［Ｊ］． 中国野生植物资源，２００１，２０（１）：４９－５０．

［６］ 文涛，梁莉，曾杨，等． 不同光照强度对虎杖愈伤组织的影响［Ｊ］． 中国中药杂志，２００７，３２（１３）：１２７７－１２８

［７］ 夏海武，吕柳新． 虎杖不同部位白藜芦醇含量的分析［Ｊ］． 植物资源与环境学报，２００５，１４（３）：５５－５６．

［８］ 张烜，胡君萍，韩玫，等． ＨＰＬＣ法测定花生不同部位中白藜芦醇的含量［Ｊ］． 新疆医科大学学报，２００３，２６（５）：４４０－４４１．

［９］ 杨培君，李会宁，赵桦． 虎杖的组织培养与快速繁殖［Ｊ］． 西北植物学报，２００３，２３（１２）：２１９２－２１９５．