基于iTRAQ技术结合2D—LC—MS/MS研究黄连对CYP450同工酶表达的影响

报告基团和平衡基团。该技术不仅可以相对定量，也可以绝对定量。使该技术在医学和生物制药领域受到高度关注和广泛应用^[12-13]。本课题组将采用iTRAQ技术结合 2D-LC-MS/MS研究黄连对肝脏CYP450酶的影响，在复杂的生物系统中，将蛋白质组学技术引入中药体系中，为预测临床应用黄连与其他药物合用时可能发生相互作用提供理论依据，从而提高临床应用黄连治疗多种疾病的有效性和安全性。

1 材料

1.1 药品 所选用的黄连购买于哈尔滨世一堂药店，经黑龙江中医药大学药用植物学教研室苏连杰教授鉴定符合2015年版《中国药典》规定。

1.2 试剂 iTRAQ Reagents Multiplex Kit（Applied Biosystem），iTRAQ Reagents Application Kit-Plasma（Applied Biosystem），乙腈（Fisher Scientific），甲醇（Fisher Scientific），BCA Protein Assay Kit（康为世纪），组织蛋白提取试剂盒（康为世纪），SDS凝胶试剂盒（康为世纪），考马斯亮蓝染料G250（Amesco），双蒸水为本实验室用MilliQ纯水仪制备，乙醇（Fisher Scientific），甲酸（Fisher Scientific）， Proteo Prep Blue Albumin and IgG Depletionkit（sigma），胰蛋白酶（Promega），Durashell-C₁₈（Agela），10K超滤管（100个/Pack，Sartorious），strata-X C₁₈除盐柱（phenomenex），进样瓶（Agilent，5183-2072），瓶盖（Agilent，5185-5829），内称管（Agilent，5182-0549），喷针（new objective，PN：FS360-20-10-N-20-C12），半胱氨酸封闭试剂（Applied Biosystems iTRAQTM试剂），还原试剂[tris-（2-Carboxyethyl）phosphine， TCEP，Applied Biosystem]。

1.3 中药水煎液的制备 按临床常用方法对药物进行处理。称取定量的上述药材，加入10倍量水，浸泡60 min，快速加热至沸腾，煎煮60 min，倾出药液，残渣再加入8倍水，煎煮提取60 min。合并2次药液，滤过，黄连浓缩至含生药量为0.35 g·mL^-1的中药水提液，4 ℃储存备用^[14]。

1.4 动物分组及给药 雌性SD大鼠20只，体重（180±20） g，购自黑龙江中医药大学医学实验动物中心，动物合格证号SCXK黑2014005，置动物笼饲养，保持室内温度18～22 ℃，室内昼夜自然明暗交替照明，饲养标准大鼠饲料。将大鼠随机分为2组，空白对照组和黄连组，每组各10只。大鼠适应7 d后，每天分别按给药容积为20 mL·kg^-1体重灌胃生理盐水和黄连水煎液，黄连组剂量均为临床人用高限剂量的42倍，各组饲养过程中保持温度、光照、湿度等环境条件均衡，自由进食饮水。

2 方法

2.1 样品制备 给药组连续诱导7 d后，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（1.5 μL·g^-1），迅速打开腹腔，从门静脉注射冰冷的生理盐水，清除残留血液，取出肝脏，用冰冷缓冲液洗净，去除肝脏表面的血液，用滤纸吸干表面液体，称重。采用差速离心法提取肝微粒体（SH-Genmed），BCA蛋白定量和聚丙烯酰胺凝胶试剂盒检测完整性（beyotime biotechnology， China）。具体操作参照说明书。

2.2 样品酶解步骤 蛋白定量后取100 μg蛋白溶液置于离心管中；加入4 μL还原试剂，37 ℃反应¹ h；加入2 μL 半胱氨酸封闭试剂，室温10 min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10 K的超滤管中，¹2 000 r·min^-1离心20 min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的裂解液（Dissolution Buffer） 100 μL，12 000 r·min^-1离心20 min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量2～4 μg，37 ℃反应过夜；次日，¹2 000 r·min^-1离心20 min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50 μL Dissolution Buffer，12 000 r·min^-1离心20 min，与上步合并，收集管底部共得到150 μL酶解后的样品。

2.3 标记步骤 从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入200 μL乙醇，涡旋振荡；取75 μL样品（100 μg酶解产物）转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂填加到样品中，涡旋振荡，室温反应2 h；加入100 μL水终止反应；混合标记后的样品，涡旋振荡；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用。

2.4 高pH反相分级 流动性A （pH 10，含2%乙腈，0.1%甲酸胺），B（pH 10，含20 mmol·L^-1甲酸胺，80%乙腈）。抽干后样品150 μL流动相A复溶，涡旋振荡，12 000 r·min^-1离心20 min，上清液上样；流速0.8 mL·min^-1；梯度分离，0～6 min，5%B，6～6.1 min，5%～8%B，6.1～30 min，8%～30%B，30～39 min，30%～50%B，39～40 min，50%～80%B，40～44 min，80%B，44～45 min，80～5% B，45～55 min，5%B。第5 min开始，依次收集每分钟洗脱物至离心管，编号1～46，真空冷冻离心干燥，抽干后的样品冷冻保存待用。

2.5 纳升级反相色谱-TripleTOFTM 5600进行蛋白质分析 根据紫外监测情况，将高pH反相分离得到的46个组分合并为10个组分，合并原则为，组分1～46靠近梯度开始和终止的组分进行合并，如1，2与45，46进行合并，依次向中间进行；此外，根据紫外检测情况，调节合并的管数，尽量使合并后的组分肽段含量一致。合并时采用含0.1%甲酸胺的2%乙腈30 μL，加入第1个离心管，涡旋振荡并离心后，转入第2个离心管，依次合并组分最后1管；¹2 000 r·min^-1离心10 min，吸取上清上样；上样体积8 μL，采取夹心法上样；装载泵流速2 μL·min^-1，15 min；缓冲液 B1 （98%乙腈， 0.1%甲酸胺），流速0.3 μL·min^-1；梯度洗脱，0～0.1 min，5%～8%B1，0.1～60 min，8%～27%B1，60～74.9 min，27%～50%B1，74.9～75 min，50%～80% B1，75～80 min，80%B1，80～80.5 min，80%～5%B1，80.5～90 min，5%B1。

2.6 数据库搜索 采用ProteinPilotTM 4.5和DAVID Bioinformatics Resources 6.7分析差异蛋白的生物过程、分子功能和代谢通路。Cytoscape 3.2.0，IntAct^[15]和MINT^[16]对差异蛋白进行蛋白相互作用分析。

3 结果

3.1 2D LC-MS/MS定量 CYP450酶 采用ProteinPilotTM Software 4.5筛选鉴定差异蛋白。差异蛋白必须满足2个条件：筛选的差异表达的蛋白具有2个或以上特异性肽段。理论上，每个蛋白都有消化后所得出的不同肽段，这些肽段的质量（相对分子质量）就是这个蛋白的肽指纹图。当一个未知蛋白被酶解，用质谱可以检测出几乎所有肽段的质量。然后把这些质量与数据库中已知的所有蛋白指纹进行匹配；差异蛋白质的变化比率上调1.2倍以上或者下调0.6倍以上。CYP2A1质谱图见图1。根据上述差异蛋白筛选要求，黄连与空白组比较共鉴定出15个差异蛋白，见表1。

3.2 黄连组差异蛋白显著性功能分析 采用DAVID 6.7软件，将ProteinPilotTM Software 4.5鉴定的差异蛋白进行分子功能 （molecular function） 和生物过程（biological progress）进行分析。选择 P<0.01 的功能为显著性功能。差异表达的蛋白生物过程主要分布在氧化还原。分子功能分析表明，差异表达蛋白主要具有结合和催化作用，见图2。

3.3 差异蛋白通路分析 采用KEGG对差异蛋白进行通路分析，差异蛋白参与的途径包括药物代谢、维生素A代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、细胞色素P450的外源性代谢，见图3。

3.4 差异蛋白相互作用分析 Cytoscape 源自系统生物学，用于将生物分子交互网络与高通量基因表达数据和其他的分子状态信息整合在一起。其最强大的功能在于大规模蛋白质与蛋白质相互作用、蛋白质-DNA或遗传分子交互作用的分析。筛选出15个差异蛋白，在数据库搜索得到蛋白的ID， 在Cytoscape 3.2.0 中的数据库进行检索，从而得到不同数据库的网络图，见图4。红色系为log2Ratio取值为正数，蓝色系为log2Ratio取值为负数，黄色为原表中未提到的蛋白信息；椭圆形的大小是依据degree来进行调配，degree越大则图形相对大小越大。degree，即在一个蛋白互作网络图中，如果一个蛋白与很多其它蛋白之间存在直接联系，则该蛋白居于中心位置，可以发挥较大的调节作用。degree是用网络中与该点有直接联系的点的数目来计算。数值越大，表示与该蛋白有直接作用的蛋白数越多。

4 讨论

蛋白质组概念在1994年由澳大利亚大学者Wilkins与Williams提出，是指在特定的时间和空间内一个基因组、一种组织或一种生物、细胞所表达的不同的颜色代表不同的蛋白表达，蓝色为下降，红色为增加，黄色为相关蛋白。

包括所有亚型以及经过修饰的全部蛋白质^[17-18]。蛋白质的表达、结构和功能分别称为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学，是蛋白质组学主要研究内容。国内外对蛋白质组学的研究越来越多，蛋白质组学主要研究内容包括，对蛋白质的识别、定量化、确定蛋白在细胞内外的定位、修饰、反应等，最后明确各种蛋白质的主要功能。蛋白都具有特定的功能，可以随血液流动到达机体的每个部位，人类通过对蛋白质组学的研究，充分了解和明确人类生命进程的规律性和关联性。中药相关药物代谢酶的研究是中医研究的重点和难点，很难突破和创新，但人们一直在摸索和开拓适合研究中药药物代谢的方法和技术。蛋白质组学系统地将细胞、器官、组织等不同层次进行了全面整合，而这种全面整合就是蛋白质组学的重点，同时也和中药理论强调的重点有相似性。本实验采用iTRAQ技术，避免了仪器和操作造成的误差，iTRAQ技术的优越性在蛋白质组学中得到证明。

采用肝脏组织，有效富集了肝脏微粒体，肝微粒体是CYP450在肝细胞内最主要的分布场所，细胞色素P450存在生物体内，参与各种内源性和外源性的物质代谢，与药物代谢相关的CYP450酶系主要有CYP1，CYP2，CYP3^[19-20]。细胞色素P450酶的表达主要有2种类型：酶的诱导或酶的抑制。其活性的变化会影响其他药物的代谢，使药效减弱或增强，甚至产生副作用或毒性。黄连可以降低CYP450 （2E1， 3A9， 2C23， 1A2， 2C70， 2A1， 4A14，7A1） 的蛋白表达；对CYP450 （2D3，2B2，2J3，2D26，2C7，2C6）和Lanosterol 14-alpha demethylase蛋白表达有增强作用，但是对CYP450（2D10，4F1，4A10， 3A18，4V2，2D1，4B1，4A2，2C13，17A1，20A1，2B3，27A1， 2C12， 2D4）的表达没有影响，临床联合用药物时应该注意选择。

近年来中药之间、中药与西药联合应用而产生毒性的事件逐渐引起人们的重视，为明确药物相互作用的规律性，学者们开始广泛研究中药对CYP450酶系的影响^[21-22]。目前，在临床实践中药物联合应用产生药物相互作用引发疾病受到广泛关注，其中产生药物相互作用的原因很多，大多数的研究主要都集中在西方药物之间的相互作用，西方与传统中药引发药物相互作用往往被人们忽视。多数中药和西药在体内都经CYP450酶代谢，这些药物对CYP450酶有诱导或抑制作用。西药与药物代谢酶之间的相互作用比较明确。中药成分比较复杂，机制不明确，需要大量开展中药对药物代谢酶影响的研究，探讨中药和西药或者中药和中药之间的药物相互作用。该研究不但可以预测中药的体内代谢过程，而且能为临床上药物配伍使用提供直接依据。

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[责任编辑 孔晶晶]