滇龙胆GrHMA基因的克隆和原核表达

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摘要：HMA蛋白（heavy metal transporting ATPase）是一种在植物中广泛存在的多功能蛋白。根据滇龙胆转录组GrHMA基因序列，设计特异性引物，通过RT-PCR扩增GrHMA基因序列，并进行TA克隆、测序及序列分析；构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrHMA，转入E.coli Rosetta（DE3）中，并在37℃、1.Ommol/L IPTG下成功诱导表达。序列分析表明，GrHMA基因是HMA超家族的成员；GrHMA氨基酸序列系统发育分析表明，CrHMA与TcHMA处于同一进化枝。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。这些结果为GrHMA蛋白的进一步纯化及结构和功能的研究奠定基础。

关键词：滇龙胆；GrHMA基因；克隆；原核表达

中图分类号：Q786

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）03-0211-07

滇龙胆（Gentiana rigescens）为龙胆科（Gen-tianaceae）龙胆属多年生宿根草本植物，是我国特有物种，主要分布于云南、贵州、四川、广西等省，其中云南是主要产区。野外主要生长在海拔1100～3000m杂木林下、荒坡地、山谷灌木丛旁[1]。滇龙胆在云南有悠久的药用历史[2]，被《中国药典》2010年版收录，为传统中药材龙胆的植物主要来源之一[3]。目前，国内外对滇龙胆的研究主要集中在栽培、农艺性状、化学成分研究、矿质元素测定等方面[4-6]，而对滇龙胆的重金属转运蛋白及其逆境胁迫和抗性研究未见报道。

重金属ATP酶（heavy metal transporting AT-Pase，HMA），又称为P1B-ATPase，其能选择性地运输Cu+、Cu2+、Zn2+和CO2+等必须的金属离子，还能转运Cu2+、Cd22+和Pb2+等重金属离子[7]；因其含有一个保守的内膜基序（CPx：Cys-Pro-Cys/His/Ser），又称为CPx-ATPase[8，9]。植物HMA除参与重金属离子的稳态外，还涉及植物对重金属的吸收、转运、解毒和富集等方面[10，ll]。HMA基因在植物中广泛存在，如在低等植物绿藻（Chlamydomonas rein-hardtii）中克隆到3个基因（CrHMA1～3），红藻（Cyanidioschizon merolae）中克隆到2个基因（CmHMA1，CmHMA2）。单子叶植物水稻（Oryzasativa）基因组中发现9个HMA基因（OsHMAl～9），大麦（Hordei vulgaris）中有10个HMA基因（HvHMAl-HvHMA10）[11～13]。于拟南芥（Arabidop-sis thaliana）中克隆到8个HMA基因（AtHMA l～8） [12，14]，大豆（Glycine max）基因组中发现9个HMA基因（GmHMAl～GmHMA9）[15]。此外，Southron、Pa-poyan等16，17]从甘蓝型油菜（Brassica napus）克隆到了P1B-ATPase基因BnRANl（HMA7）；Courbot等[18]从重金属Zn/Cd超富集植物鼠耳芥（Arabidopsishaller）中克隆到AhHMA4；Cobbett、Bernard等[8，19]从遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）中克隆到TcHMA4基因。植物基因组中有多个HMA基因存在，其蛋白在植物的根、茎、叶和细胞中的叶绿体、内质网、高尔基体、液泡和质膜上均有定位[20]。根据重金属的底物特异性可以将P1B-ATPase分为两个亚类：Zn2+/CO2+/Cd2+/Pb2+P1B-ATPase（Zn亚类）和Cu+/Ag+P1B-ATPase（Cu亚类），其中动物只有Cu亚类[11，21]。植物中则包含这两个亚类，如拟南芥AtHMAl-4属于Zn亚类，而AtHMA5-8属于Cu亚类[21]；水稻OsHMAl-OsHMA3属于Zn亚类，OsHMA4-OsHMA9属于Cu亚类[13]。

虽然HMA蛋白在植物中广泛分布，但目前的研究仍仅局限于拟南芥，在重金属超富集植物中没有进行系统全面的研究，而在药用植物滇龙胆中至今未有报道。本研究根据3年生滇龙胆的转录组中GrHMA基因序列设计特异性引物，从滇龙胆幼叶中提取RNA，反转录为cDNA，进而扩增到GrHMA基因序列，并进行TA克隆、测序和序列分析；构建GrHMA基因原核表达载体，在大肠杆菌Rosetta中进行表达，使用SDS-PAGE检测其蛋白表达情况。结果显示GrHMA基因为HMA基因家族的成员，在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导下成功表达，这将为滇龙胆GrHMA蛋白的纯化、结构和功能研究奠定基础，也为植物、动物、微生物中HMA的研究提供参考。

1材料与方法

1.1植物材料

供试材料滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）种植于云南省农科院药用植物研究所种质资源圃（25°08"04.50"N，102°46"15.05"E）。栽培地海拔1942m，年平均气温14.7℃，年平均降水量980～1050mm，极端高温30.4℃，极端低温-0.2℃。试验材料为滇龙胆长势良好的幼叶。

1.2菌株、载体、酶等主要试剂

工程菌E.coli Trans 5α、E.coli Rosetta（DE3）、RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue Reagent、反转录试剂盒、限制性内切酶BamH I和Xho I及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、X-gal等均购买于宝生物工程（大连）有限公司；高纯质粒小量制备试剂盒（离心柱型）、多功能DNA纯化回收试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；质粒pGEX-4T-l由玉溪师范学院分子生物学实验室保存；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。