BRAF基因与甲状腺癌分子诊疗的研究进展

【摘要】 对甲状腺结节进行细针穿刺细胞学检查，给临床医生诊断甲状腺肿瘤提供了一个新的信息。该技术在甲状腺癌的临床诊断中，特别是BRAF基因的应用，在一定程度上提高了甲状腺癌诊疗水平。国内外最新研究表明，BRAF基因检测为甲状腺癌的诊断和预后提供了参考，并给临床上甲状腺癌的初始化治疗指明了一个方向。对于临床细针穿刺细胞学检测不能确定的甲状腺癌，BRAF分子检测技术可作为一个有用的检测手段，为临床诊断甲状腺癌提供一个决定性的参考，使更多的甲状腺癌患者得到个体化的治疗。本文就BRAF基因与甲状腺癌分子诊疗的关系进行综述。

【关键词】 BRAF； 细胞学； 分子诊断； 甲状腺癌

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，甲状腺癌来自滤泡或者滤泡旁细胞。滤泡源性肿瘤最普遍存在于甲状腺癌中，包括乳头状癌、卵泡癌和嗜酸性细胞癌。这些分化型甲状腺癌占所有甲状腺恶性肿瘤的95%[1]。过去几十年里整个西方世界甲状腺癌的发病率在增加。我国甲状腺癌的发病率由10/100万升到约30/100万～40/100万；而美国则增长了300%，乳头状癌大概占所有甲状腺癌的80%～90%[2]。临床上诊断甲状腺癌的方法非常多，如细针穿刺细胞学检查、PET/CT、DNA测序荧光原位杂交、PCR、逆转录PCR、实时PCR以及单链构象多态性分析PCR等，在一定程度上都能对甲状腺癌的诊断提供帮助，但在准确率上存在一定的假阴性。最近的研究表明，对甲状腺结节进行BRAF基因的检测对于排除或诊断甲状腺癌具有重要的临床意义。由此可见，BRAF基因的检测在甲状腺癌的临床诊断中扮演着至关重要的作用。以下就临床上对甲状腺癌诊断具有重要作用的检测方法进行阐述。

1 细针穿刺细胞学检查在甲状腺癌诊断中的局限性

1.1 细针穿刺细胞学检查的局限性 甲状腺结节为临床上常见的甲状腺疾病，但仅有5%的甲状腺结节发展为恶性肿瘤。术前通过对甲状腺结节进行细针穿刺细胞学检测是目前诊断甲状腺肿瘤的一个较好的诊断方法。是使用细针及针管，刺入病变区域内，通过提插等方式将病灶内的细胞或小组织块切割下来，同时借助针管内负压将其吸出，涂片及染色后在光镜下阅片，最后完成病理诊断的一种活检方法。其目的主要为诊断是否肿瘤、良恶性及类型，已成为肿瘤确诊的主要手段之一，尤其是近10年来影像技术的发展，在B超引导下，应用细针穿刺对浅表肿块，如乳腺、甲状腺、淋巴结等进行细胞学活检，是早期诊断肿瘤的最快捷、简便与安全的方法。研究表明，对穿刺出的组织样本进行分子生物学检测可明显提高该疾病细胞学诊断的准确度[3]，但其仍存在一定的局限性，主要包括以下几个方面：（1）不能从良性配对物中分辨卵泡状细胞癌还是嗜酸性细胞腺癌；（2）有造成恶性肿瘤转移和扩散的可能性；（3）穿刺为有创性的检查，可能会损伤血管或神经等；（4）穿刺不到位，有可能导致阴性结果的出现，从而延误疾病的诊疗时机。

1.2 贝塞斯达甲状腺细胞穿刺分级系统在甲状腺癌诊断中的作用 为了指出细胞穿刺的诊断局限性，这个分级系统提出了以下几种分类：不符合要求的、良性、恶性、不确定恶性肿瘤的、非典型和可疑性肿瘤的。这些分类最近已在一个学术机构被前瞻性的测试过[4]。学者们在一年内收集了3207例甲状腺结节，评估发现这些病例中不符合要求的有11.1%，良性73.8%，恶性5.2%，不确定恶性肿瘤的9.8%：其中包括5.5%滤泡性肿瘤/许莱特细胞肿瘤，3%非典型和1.3%可疑性肿瘤。378例患者接受了外科手术，有2.2%的假阳性率。贝塞斯达系统作为所有肿瘤的筛选方式，其特异性为68%，而作为恶性肿瘤的诊断方式其特异性为93%。还有一些学者发现，不确定恶性肿瘤中的恶性风险：非典组17%，滤泡性肿瘤25.4%，可疑性肿瘤组为70%[5]。这些结果说明，即使没有对穿刺出的组织进行细胞学检测，可疑性肿瘤组的恶性风险非常高，需要引起专科医生的重视[4-5]。关于分子诊断，国家癌症研究所的建议中明确规定：鉴于目前有限的证据，进一步的研究应适应临床使用的需要[6]。

2 分子检测技术在诊断甲状腺癌中的作用

能检测各种标本分子突变的生物技术在临床检测中被广泛应用，这些标本不仅限于血液、唾液试纸、新鲜的冰冻组织、细针穿刺组织，还包括福尔马林固定石蜡包埋的组织。当今临床实验室常见的分子分析技术包括DNA测序荧光原位杂交、PCR以及一些改良的分子检测技术，如逆转录PCR、实时PCR、单链构象多态性分析PCR。沈樑等[7]对21例甲状腺癌患者应用亚甲蓝染色法行前哨淋巴结活检（sentinel lymph-node biopsy，SLNB），对SLN进行HE染色、细胞角蛋白19（CK19）的免疫组化染色（IHC）及RT-PCR检测，比较三种方法对SLN微转移灶检出的敏感性、准确率的差异。结果21例中，成功检出SLN 16例，检出率为76.2%。IHC、RT-PCR与HE比较差异有统计学意义。表明前哨淋巴结活检可有效判断甲状腺癌转移状态，应用RT-PCR检测CK19在SLN中的表达，可提高敏感度及准确率。

3 BRAF基因的分子结构、生物学功能以及在甲状腺癌诊断方面的作用

3.1 BRAF基因的分子结构及生物学功能 BRF基因，别名鼠类肉瘤滤过性毒菌（v-raf）致癌同源体B1；1988年由Ikawa等[8]首先在人类尤文氏肉瘤中发现并将其克隆出来，是一个能对NIH3T3细胞进行转染且具有生物学活性的一种DNA序列；由于其与CRAF基因、ARAF基因的同源性非常的高，故又有学者将其称为BRAF基因。BRAF基因由783个氨基酸组成，位于染色体7q34的BRAF基因能够编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是RAF家族成员之一，而且还是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信号通路中相当重要的转导因子。BRAF基因突变引起机体患病主要是通过以下两种途径：（1）遗传基因的突变而导致先天性缺陷疾病的途径；（2）后天获得致癌基因而导致肿瘤发生或形成的途径，其生物学功能主要体现在调控细胞生长、分化和凋亡等[9]。

3.2 BRAF基因与甲状腺癌诊断方面的关系 BRAFFT1799A（V600E）位点与RAS蛋白结合后发生谷氨酸至缬氨酸的点突变，因而引起了MAPK通路中REK和MEK的肿瘤基因的级联激活反应[10]。迄今为止，V600E点突变是BRAF基因中最常见的遗传病变，约占乳头状癌的45%[11]。而临床上少见的BRAF基因K601E点突变和AKAP9-BRAF重组常与辐射相关的乳头状癌发生有关[12]。研究发现，仅1%～2%乳头状癌与此突变相关[11-12]。从组织学上，BRAF显示出对乳头状癌家族的局限性[11]。这在不同的滤泡性乳头状甲状腺癌中几乎没有发现。在低分化肿瘤中，BRAF突变越来越多的在去分化频谱从高分化焦点到大细胞中的低分化区域和孤立的突变和未分化癌中的每一阶段被检测到[13]。这也就为突变既在肿瘤发生起到了早期作用，也在癌症的生物学去分化中起到作用；同样的，BRAF也与一定的临床因素相关，如老年患者的年龄、甲状腺外肿瘤的转移、淋巴结转移、肿瘤的分期、疾病的再发、再手术等[14]。

4 BRAF基因的临床意义

BRAF基因的意义在于它不仅可作为一种诊断的手段，对预后也有一定的意义。考虑到它与一些侵袭性疾病具有相关性，许多学者提出对于BRAF阳性的甲状腺癌患者相对于阴性的患者而言具有更强的侵袭性，从而在治疗上需要施行甲状腺全切术加中心淋巴结清除，术后需要更高剂量的放射性碘治疗，更低的促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）抑制，并且密切随访。分子标记物（如BRAF基因）有助于在细胞形态学不典型和取样不佳的情况下做出比较有效的诊断，在细胞形态不典型和可疑时对明确肿瘤的性质具有重要意义[15]。近期一项研究表明，BRAF在肿瘤中预测淋巴结的侵袭性可能与肿瘤的大小相关[16]。这项研究对100例为单发病灶的甲状腺乳头状癌患者进行BRAF检测，根据这100例患者手术所切除肿瘤的大小分成三类：小于0.5 cm、0.5～1 cm、大于1 cm。尽管这三类BRAF的突变率相似，但是BRAF仅仅反映第二组的淋巴结侵袭性。这表明BRAF对亚厘米级的微型癌具有风险评估的意义。

5 展望

细针穿刺细胞学检查、免疫组化染色（IHC）及RT-PCR检测技术等对甲状腺癌的诊断起到了至关重要的作用。从分子生物学角度来讲，甲状腺肿瘤患者体内存在多种分子标记物。但在诊断上，具有明确价值的方法主要是结合外科手术前细胞形态学和分子标记物的检测结果。另外，也发现在甲状腺肿瘤患者体内存在一些基因的改变，如BRAF基因分析作为诊断标志已成为诊断甲状腺肿瘤非常有效的方法，但是它对预后的作用还需进一步的研究[3，10，14，17]。此外，一些基因的突变可能对于甲状腺癌的预后具有重要意义，如BRAF，这使得很多人对于积极恰当的外科手术和药物治疗某些确定的甲状腺癌的方法提出了一些质疑[17]。因此，BRAF分子诊断为甲状腺癌的诊断、治疗和预后提供了一个新的方法，进一步的临床研究为日后正确治疗此类疾病提供最佳的诊断方法尤其重要。未来，是否可以将其整合到甲状腺癌的诊断和治疗等各项工作中，值得科研人员和专科医生进一步的努力。

参考文献

[1] Nikiforov Y E.Molecular diagnostics of thyroid tumors[J].Arch Pathol Lab Med，2011，135（24）：569-577.

[2] 应敏刚，陈建顺，肖景榕，等.长乐市1988-2002年恶性肿瘤发病率时间趋势分析[J].中国肿瘤，2005，14（1）：32-34.

[3] 吕云福，顾文彪，谢贤和.甲状腺癌相关肿瘤分子标志物研究进展[J].国际外科学杂志，2011，32（2）：92-96.

[4] Theoharis C G，Schofield K M，Hammers L，et al.The Bethesda thyroid fineneedle aspiration classification system：year 1 at an academic institution[J].Thyroid，2009，19（6）：1215-1223.

[5] Jo V Y，Stelow E B，Dustin S M，et al.Malignancy risk for fine-needle aspiration of thyroid lesions according to the Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology[J].Am J Clin Pathol，2010，134（24）：450-456.

[6] Baloch Z W，Livolsi V A，Asa S L，et al.Diagnostic terminology and morphologic crieria for cytologic diagnosis of thyroid lesions： a synopsis of the National Cancer Institute Thyroid FNA State of the Science Conference[J].Diag Cytopathol，2008，36（14）：425-437.

[7] 沈樑，黄颖烽，梁柳森，等.甲状腺癌前哨淋巴结微转移分子检测及其临床意义[J].临床医学，2008，28（11）：98-99.

[8] Ikawa S，Fukui M，Ueyama Y，et al.B-raf，a new member of the raf family，is activated by DNA rearrangement[J].Mol Cell Biol，1988，8（6）：2651-2654.

[9] Ji H，Wang Z，Perera S A，et al.Mutations in BRF and KRS converge on activation of the mitogen-activated protein kinase pathway in lung cancer mouse models[J].Cancer Res，2007，67（10）：4933-4939.

[10] Xing M，Tufano R P，Tufaro A P，et al.Detection of BRAF mutation on fine needle aspiration biopsy specimens： a new diagnostic tool for papillary thyroid cancer[J].J Clin Endocrinol Metab，2004，89（42）：2867-2872.

[11] Giordano T J，Kuick R，Thomas D G， et al.Molecular classification of papillary thyroid carcinoma： distinct BRAF，RAS，and RET/PTC mutation-specific gene expression profiles discovered by DNA microarray analysis[J].Oncogene，2005，24（15）：6646-6656.

[12] Hou P，Liu D，Xing M.Functional characterization of the T1799-1801del and A1799-1816ins BRAF mutations in papillary thyroid cancer[J].Cell cycle，2007，24（6）：377-379.

[13] Nikiforov Y E.Genetic alterations involved in the transition from well differentiated to poorly differentiated and anaplastic thyroid carcinomas[J].Endocrine Pathol，2004，15（4）：319-327.

[14] Lupi C，Giannini R，Ugolini C，et al.Association of BRAF V600E mutation with poor clinicopathological outcomes in 500 consecutive cases of papillary thyroid carcinoma[J].J Clin Endocrinol Metabo，2007，92（35）：4085-4090.

[15] Ohori N P，Nikiforova M N，Shoedel KE，et al.Contribution of molecular testing to thyroid fine-needle aspiration cytology of "follicular lesion of undetermined significance/atypia of undetermined significance"[J].Cancer Cytopathol，2010，118（54）：17-23.

[16] So Y K，Son Y I，Park J Y，et al.Preoperative BRAF mutation has different predictive values for lymph node metastasis according to tumor size[J].Otolaryngol Head Neck Surg，2011，145（64）：422-427.

[17] Tufano R P，Kandil E.Considerations for personalized surgery in patients with papillary thyroid cancer[J].Thyroid，2010，20（12）：771-776.

（收稿日期：2012-11-22） （本文编辑：陈丹云）