高危型HPV,E6/E7,mRNA联合液基细胞学检查提高宫颈病变检出率的研究

[摘要] 目的 研究高危型人乳頭瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA联合液基细胞学检查提高宫颈病变检出率的应用价值。 方法 选取2016年1月～2017年12月于延安市人民医院接受宫颈病变检查的249例患者为研究对象，其中宫颈炎症（170例）、宫颈上皮内瘤变Ⅰ（CINⅠ）（32例）、CINⅡ（28例）、CINⅢ（14例）、宫颈癌（5例）。对所有患者均进行高危型HPV E6/E7 mRNA检查、液基细胞学检查以及组织病理活检。并以病理活检结果为金标准，比较不同检查方式的检出率、灵敏度、特异性。 结果 高危型HPV E6/E7 mRNA检查对宫颈炎症、CIN的检出率分别为83.53%、71.62%，均明显高于液基细胞学检查的68.24%、56.76%，又明显低于联合检查的94.71%、90.54%，差异均有统计学意义（P < 0.05）。高危型HPV E6/E7 mRNA检查诊断CINⅠ的检出率为68.75%，明显高于液基细胞学检查的43.75%，又明显低于联合检查的90.63%，差异均有统计学意义（P < 0.05）。高危型HPV E6/E7 mRNA检查与液基细胞学检查诊断癌前病变的灵敏度分别为76.60%、68.09%，均明显低于联合检查的91.49%；高危型HPV E6/E7 mRNA检查诊断癌前病变的特异性为81.19%，明显高于液基细胞学检查的64.36%，又明显低于联合检查的94.06%，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 高危型HPV E6/E7 mRNA联合液基细胞学检查可显著提高宫颈病变检出率，具有较高的临床诊断价值，推广应用价值较好。

[关键词] 宫颈病变；高危型人乳头瘤病毒；液基细胞学检查；宫颈上皮内瘤变

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（b）-0080-04

[Abstract] Objective To study the application value of the high-risk human papillomavirus （HPV） E6/E7 mRNA combined with liquid based cytology in the improvement of detection rate of cervical lesion. Methods From January 2016 to December 2017， 249 patients with cervical lesions in Yan′an People′s Hospital were selected as the subjects. There were 170 cases of cervical inflammation， 32 cases of cervical intraepithelial neoplasia Ⅰ （CIN Ⅰ）， 28 cases of CIN Ⅱ， 14 cases of CIN Ⅲ， 5 cases of cervical cancer. The detection of high-risk HPV E6/E7 mRNA， liquid based cytology and histopathological biopsy were carried among all patients. The detection rate， sensitivity， and specificity of different examination methods were compared with the results of pathological biopsy. Results The detection rate of high risk type HPV E6/E7 mRNA examination in the diagnosis of cervical inflammation， CIN was 83.53%， 71.62%， which was significantly higher than liquid based cytology of 68.24%， 56.76%， and was significantly lower than the joint detection of 94.71% and 90.54% respectively， the differences between groups were statistically significant （P < 0.05）. The detection rate of high-risk type HPV E6/E7 mRNA examination in the diagnosis of CIN Ⅰwas 68.75%， which was significantly higher than the liquid based cytology of 43.75%， the joint detection was significantly lower than the 90.63%， the differences between groups were statistically significant （P < 0.05）. The sensitivity of the high-risk HPV E6/E7 mRNA examination and the diagnosis of precancerous lesions was 76.60% and 68.09% respectively， which was significantly lower than 91.49% of the joint detection. The specificity of high-risk HPV E6/E7 mRNA in diagnosing precancerous lesions was 81.19%， which was significantly higher than the liquid based cytology of 64.36%， was significantly lower than the joint detection of 94.06%， the differences between groups were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The high risk HPV E6/E7 mRNA combined with cytological examination can significantly improve the detection rate of cervical lesions， which has higher clinical diagnostic value， and worth popularizing.

[Key words] Cervical lesions； Human papillomavirus of high-risk type； Cytological examination of liquid base； Cervical intraepithelial neoplasia

宫颈癌是全球范围内较为常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，其病死率在女性恶性肿瘤疾病中位居第四，严重威胁着女性人群的生命健康安全[1]。因此，对宫颈癌患者进行早期有效的诊断及干预显得尤为重要。近年来，随着相关研究的不断深入，有研究显示，高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）高负荷量与持续性感染在宫颈癌的发生、发展过程中发挥着至关重要的作用[2]。另有研究报道表明，高危型HPV的E6与E7基因所表达的蛋白具有干扰细胞周期、凋亡以及染色体稳定的作用，从而会促使细胞永生化，进一步引发宫颈癌[3]。鉴于此，本文通过研究高危型HPV E6/E7 mRNA联合液基细胞学检查提高宫颈病变检出率的应用价值并予以分析，旨在为临床早期诊断宫颈癌提供一种有效手段，进一步为临床治疗方案的制订提供参考依据，现作以下报道：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月～2017年12月于延安市人民医院接受宫颈病变检查的249例患者为研究对象。纳入标准[4]：①年龄>18岁；②性生活史≥2年；③非月经期；④临床病历资料完整。排除标准：①入院前3 d接受过阴道用药或阴道冲洗或进行性生活者；②既往有HPV感染史者；③有宫颈手术史者；④存在神经系统疾病或交流沟通障碍者。年龄20～77岁，平均（45.62±11.38）岁。根据疾病类型不同分为宫颈炎症170例，宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）74例，其中根据CIN分级标准：CINⅠ32例、CINⅡ28例、CINⅢ14例，宫颈癌5例。所有患者均签署了知情同意书，医院医学伦理委员会已批准。

1.2 研究方法

1.2.1 高危型HPV E6/E7 mRNA检测 采用专门的HPV取样器采集患者宫颈分泌物样本，并将其置入15 mL的离心管中，以3000 r/min（半径为80 mm）连续离心5 min，去除上清液，采用2 mL的蒸馏水进行清洗后再次离心处理，去除上清液，随后加入300 μL的裂解剂蛋白酶K，放置于65℃条件下静置30 min，取出后采集上清液，应用高危型HPV E6/E7 mRNA检查试剂盒（购自美国Hologic公司）予以检测，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。通过计算机软件自动读取高危型HPV E6/E7 mRNA拷贝数值，结果<1 copy/mL即为阴性，≥1 copy/mL即为阳性。

1.2.2 液基细胞学检查 采用液基细胞学专用取材刷彻底插入宫颈口，同一方向旋转5周，采集宫颈口以及宫颈管的脱落上皮下包，并将其置入含有PreservCyt保存液的小瓶内。予以制片、固定、染色处理后，由2名经验丰富的专业病理科医师采用双盲法进行判读，当判读结果存在差异时由2名医师讨论确定最终结果。相关仪器以及试剂均购自上海裕隆生物科技有限公司。

1.3 观察指标

比较不同诊断方式对宫颈病变的检出率，不同诊断方式对CIN的检出率。以病理活检为金标准，分析不同诊断方式诊断癌前病变的灵敏度、特异性情况。灵敏度=真阳性人数/（真阳性人数+假阴性人数）×100%。特异性=真阴性人数/（真阴性人数+假阳性人数）×100%。

1.4 CIN分级标准

①CINⅠ：细胞异型性较轻，排列不整齐但仍保持极性，且异常增殖细胞仅限于上皮层下1/3；②CINⅡ：细胞异型性较为明显，且排列紊乱，异常增殖细胞占据上皮层下2/3；③CINⅢ：异常增至的细胞扩展至上皮层的2/3或全层。将CINⅡ及以上病变记为癌前病变[5]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同诊断方式对宫颈病变的检出率比较

高危型HPV E6/E7 mRNA检查诊断宫颈炎症、CIN的检出率明显高于液基细胞学检查，又明显低于联合检查，联合检查对宫颈炎症、CIN的检出率明显高于液基细胞学检查，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 不同诊断方式对CIN的检出率比较

高危型HPV E6/E7 mRNA检查诊断CINⅠ的检出率明显高于液基细胞学检查，又明显低于联合检查，联合检查诊断CINⅠ的检出率明显高于高危型HPV E6/E7 mRNA检查，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 不同診断方式诊断癌前病变的灵敏度、特异性情况比较

高危型HPV E6/E7 mRNA检查与液基细胞学检查诊断癌前病变的灵敏度及特异度均明显低于联合检查；高危型HPV E6/E7 mRNA检查诊断癌前病变的特异性明显高于液基细胞学检查，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

HPV感染属于宫颈病变的重要原因之一，且有研究报道显示，绝大部分的宫颈癌患者均存在HPV感染[6-9]。然而，从HPV感染发展至宫颈癌需经过较长的时间，HPV感染后在体内具有较长的潜伏期，90%的患者可通过自身免疫功能予以清除，然而仍有少部分高危持续感染者会进展为宫颈癌[10-11]。目前，美国以及其他欧洲国家以将高危型HPV DNA检测联合液基细胞学检查作为宫颈癌初筛的基本方案[12-13]。然而从感染HPV开始直至癌前病变，甚至是浸润癌尚且有数年的时间，且癌前病变存在一定的进展性以及可逆转性。价值大部分HPV感染是无症状与暂时性的，绝大部分新发感染者可在短时间内消退。因此，HPV DNA虽有较高的敏感性，但特异性较低，从而可能导致过多的无意义感染检出，进一步加重患者的经济以及心理负担[14-15]。而HPV mRNA检测可检测到存在转录活性的病毒，有效提高了特异性。而液基细胞学检查广泛应用于宫颈癌的筛查中，在一定程度上提高了宫颈上皮内瘤变的灵敏度，然而该检查方式存在一定的假阳性率[16-17]。由此，笔者通过研究高危型HPV E6/E7 mRNA联合液基细胞学检查提高宫颈病变检出率的应用价值，以期为宫颈癌的筛查提供一种有效手段。

本研究发现，高危型HPV E6/E7 mRNA检查诊断宫颈炎症、CIN的检出率均明显高于液基细胞学检查，又明显低于联合检查，与此同时，高危型HPV E6/E7 mRNA检查诊断CINⅠ的检出率明显高于液基细胞学检查，又明显低于联合检查，这符合叶丽君等[18-20]的研究报道，说明了HPV E6/E7 mRNA检查诊断宫颈病变的检出率较高，且联合液基细胞学检查可明显提高检出率。究其原因，在高危型HPV持续感染引发宫颈癌的过程中，病毒DNA发生整合，从而使得病毒基因E2区开放读码框出现损害，进一步促使病毒癌基因E6与E7的上流调节出现异常，而E6/E7致癌基因的表达可通过检测其mRNA转录水平实现。因此，高危型HPV E6/E7 mRNA检测可确诊高危持续感染者，并为宫颈癌的筛查和疾病预测提供可靠信息。且与液基细胞学检查具有一定的互补作用，从而提高了临床宫颈病变的检出率。此外，高危型HPV E6/E7 mRNA检查与液基细胞学检查诊断癌前病变的灵敏度均明显低于联合检查；高危型HPV E6/E7 mRNA检查诊断癌前病变的特异性明显高于液基细胞学检查，又明显低于联合检查，这提示了HPV E6/E7 mRNA检查联合液基细胞学检查有效提高癌前病变的诊断敏感度、特异性。分析原因，HPV E6/E7属于病毒癌基因，在抑癌基因p53以及Rb的降解过程中发挥至关重要的作用，且在病毒基因整合至宿主的DNA过程中，E2片段缺失导致HPV早期基因HPV E6/E7 mRNA表达。另有研究报道显示，HPV E6/E7 mRNA会对正常细胞周期产生一定的干扰作用，从而使得细胞基因组稳定性降低，进一步导致正常的宿主细胞朝恶性方向转化[21-23]。因此，HPV E6/E7 mRNA检测可准确反映疾病发展情况。在与液基细胞学检查联合应用时，可有效降低其假阳性率，提高了临床诊断价值。

综上所述，高危型HPV E6/E7 mRNA联合液基细胞学检查可显著提高宫颈病变检出率，具有较高的临床诊断价值，值得临床推广应用。然而，本研究尚且存在样本量较少的缺陷，可能导致研究结果发生一定程度的偏倚。因此，在今后的研究中我们应增大样本量，以获取更为准确、可靠的数据。

[参考文献]

[1] Perri F，Longo F，Della Vittoria Scarpati G，et al. Metastatic HPV-related oropharyngeal carcinoma cured with chemoradiotherapy：importance of pretherapy biomolecular assessment [J]. Clin Case Rep，2017，6（1）：56-62.

[2] 冯树芳，段兆珺，潘正娟，等.HR-HPV、TCT检查联合阴道镜定位活检在宫颈癌前病变及宫颈癌筛查中的价值[J].医学信息，2016，29（8）：124-125.

[3] 于淼淼，杨露.高危型人乳头状瘤病毒DNA检测与液基薄层细胞学检查在宫颈癌癌前病变中的诊断价值比较[J].中国医学前沿杂志：电子版，2016，8（12）：75-78.

[4] 许惠惠，石卫武，徐玖飞，等.HPV基因分型在宫颈癌筛查风险分层管理中的价值[J].中华实验和临床病毒学杂志，2016，23（1）：14-18.

[5] 杨娟，关婷，蔡虹，等.高危型人乳头瘤病毒检测作为宫颈癌初筛手段的应用研究[J].中国计划生育和妇产科，2016，32（2）：32-35.

[6] 姚有娣，程易凡，王丹凤，等.宫颈液基薄层细胞学检测与人乳头瘤病毒检测对宫颈癌诊断的效用评价[J].中国性科学，2016，25（2）：44-47.

[7] 高华玲，尹德娥，杜杰，等.TCT和HR-HPV-DNA检测在宫颈癌和癌前病变筛查中的临床价值[J].标记免疫分析与临床，2017，24（10）：1115-1118.

[8] 董宇凤，高丽.HPV感染与宫颈病变的相关性及常见危险因素[J].中国性科学，2016，25（5）：35-37.

[9] 王艳君，张静.高危型HPV联合TCT在宫颈癌筛查中的价值研究[J].中国性科学，2017，26（12）：24-27.

[10] Paz-Zulueta M，álvarez-Paredes L，Rodríguez Díaz JC，et al. Prevalence of high-risk HPV genotypes，categorised by their quadrivalent and nine-valent HPV vaccination coverage，and the genotype association with high-grade lesions [J]. BMC Cancer，2018，18（1）：112-113.

[11] 祁可娜，孫铮.高危型HPV联合液基薄层细胞学检查在宫颈癌早期诊断中的价值[J].中国妇幼健康研究，2017， 28（7）：887-889.

[12] 王海瑞，廖光东，江宇，等.p16/mcm2双染在宫颈上皮内瘤变的诊断价值及其与高危型HPV感染的关系[J].中华流行病学杂志，2017，38（9）：1241-1245.

[13] 廖光东，康乐妮，李静，等.p16/微小染色体维持蛋白2和p16/Ki-67双重染色对高危型人乳头瘤病毒呈阳性妇女的宫颈病变筛查[J].中华妇幼临床医学杂志：电子版，2017，13（4）：425-431.

[14] 师晓艳，雷侠.宫颈液基细胞学检查与高危型HPV检测用于宫颈癌前病变并发感染早期筛查的对比研究[J].中国性科学，2017，26（1）：33-35.

[15] 范玲玲，黄修菊，刘新莲，等.hTERC、C-MYC基因检测在新疆维吾尔族妇女宫颈病变筛查中的意义[J].临床检验杂志，2017，35（3）：196-198.

[16] 王晓光，辛志峰，李娜，等.人乳头瘤病毒检测与薄层液基细胞学技术在宫颈癌筛查中的应用[J].现代妇产科进展，2016，25（2）：140-142.

[17] 徐萍，方筠，应春妹，等.高危型HPV DNA检测与细胞学检查用于宫颈疾病诊疗筛查的结果分析[J].检验医学，2016，31（6）：516-520.

[18] 叶丽君，喻长法，蔡莎莎，等.高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA联合液基细胞学检查在宫颈病变诊断中的应用[J].中国慢性病预防与控制，2017，25（7）：499-501.

[19] 徐瑛，高志斌，黄丽丽，等.基于数学模型的高危HPV E6/E7 mRNA定量分析在宫颈病变筛查中的作用[J].中国医学物理学杂志，2017，34（1）：76-79.

[20] 王丹，李一春，刘霞，等.人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA表达联合液基薄层细胞学检测对宫颈癌早期筛查和诊断的意义[J].中国妇幼保健，2017，32（24）：6147-6150.

[21] 王玉兰，薛剑侠，李晓旭，等.高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测在宫颈癌中的研究进展[J].山西医药杂志，2017，46（7）：778-780.

[22] Hwang SH，Shin HY，Lee DO. A prospective pilot evaluation of vaginal and urine self-sampling for the Roche cobas 4800 HPV test for cervical cancer screening [J]. Sci Rep，2018，8（1）：9015-9016.

[23] Long W，Yang Z，Li X，et al. HPV-16，HPV-58，and HPV-33 are the most carcinogenic HPV genotypes in Southwestern China and their viral loads are associated with severity of premalignant lesions in the cervix [J]. Virol J，2018，15（1）：94-95.

（收稿日期：2018-06-12 本文編辑：任 念）