肝干细胞的研究进展

【摘要】从广义上讲，肝干细胞是与肝脏胚胎发育及再生有关的各类具有干细胞特性的细胞类型的总称。由于其具有强大的增殖能力，并能分化为具有功能的成熟肝细胞，为肝脏疾病的细胞和组织层面的治疗提供了重要的细胞来源。现就肝干细胞的研究进展作一综述。

【关键词】肝干细胞；肝卵圆细胞；骨髓干细胞

【中图分类号】Ｒ２．２３９８ 【文献标识码】Ａ【文章编号】1044-5511（2011）10-0085-03

引 言

各种肝脏疾病的治愈是现阶段一个较难解决并亟待解决的问题。肝脏移植是现阶段治疗晚期肝脏疾病的有效方法，但这一方法却不能得到广泛使用。因为肝源短缺、移植后的排斥反应和高额的治疗费用等严峻问题，肝脏疾病的治疗方法一直是人们探究的问题。而干细胞所具有的强大增殖能力和分化潜能使得人们可从这一层面着手研究肝脏的治疗方法，肝干细胞有可能成为临床上细胞移植的一种可能。[1]肝干细胞可以代替坏死细胞或组织，并且可以自我更新从而达到组织再生修复的目的。[2]而体内有多种细胞符合肝干细胞的特征，根据来源不同，可分为肝源性干细胞和非肝源性干细胞，前者研究较多的为肝卵圆细胞，后者为骨髓干细胞。现就肝干细胞的研究进展作一综述。

1 肝干细胞的分类和来源

根据肝干细胞起源的不同，可将其分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞。肝源性肝干细胞主要指卵圆细胞、成熟肝细胞、胎肝干细胞等；而非肝源性肝干细胞主要包括源于胚胎干细胞、骨髓干细胞及胰腺上皮干细胞等。[3]

1.1 肝源性干细胞

1.1.1 肝卵圆细胞

卵圆细胞首先是由Kinosita在1937年报道的，它在受致癌物作用下的鼠肝内发现了体积较小、呈卵圆形的细胞，但当时的技术无法对卵圆细胞进行分离及分析[4]。直到1999 年，Sakamoto等[5]在大鼠化学致癌的早期发现了大量迅速增殖的肝非实质性上皮细胞即卵圆细胞。其形态学特点为：体积小，形态为卵圆形，核也为卵圆形，核浆比例大，胞浆嗜碱性且浅染[6]。目前对于人肝脏中与啮齿类动物卵圆细胞相似的这群细胞建议命名为肝脏祖细胞（hepatic progenitorcells，HPCs）[7]。

图1.肝卵圆细胞的活化过程[8]

图2半定量RT-PCR分析对比细胞的基因表达图谱[14]

当肝脏损伤严重，或者干细胞组织出现坏死现象，肝细胞本身再生机制障碍时，肝干细胞被激活，开始产生肝卵圆细胞。肝卵圆细胞具有多向分化潜能，体内外实验证实其可以分化为肝细胞[9-10]和胆管细胞[11]。就其分化能力而言，肝卵圆细胞属于二级干细胞，即前体细胞(progenitor cell)。这些细胞主要位于胚胎肝脏或成年哺乳动物肝脏胆管末端Hering管，也被称为微胆管或终末胆管，是汇管区肝细胞与胆管细胞之间移行部位[1]。

研究发现肝卵圆细胞在表达干细胞抗原Scal和CD34及CD35的同时，还表达A6及甲胎蛋白（AFP），说明Scal、CD34及CD35是肝卵圆细胞的特异标志[12]。肝卵圆细胞既有肝细胞的表型特征，又有胆管细胞的表型特征，如表达CK7、CK19、γ-GT等，还可以表达OV-1、OV-6、波形蛋白等表面标志物。多数研究认为肝卵圆细胞的增殖与分化与细胞外基质和多种生长因子有关，如LIF、IL-6、 OSM、TNF、TGFα、TGFβ、HGF等。卵圆细胞的替代途径是:小胆管及毛细胆管中的卵圆细胞增生、分化为单能肝脏祖细胞，肝脏祖细胞被植入人或动物体内分化成肝细胞和胆管细胞[8]（图1）1.1.2成熟肝细胞

以往常常认为成熟肝细胞就是分化的终点，但近年的观点认为成熟肝细胞在一定条件的刺激下仍然可以增殖分化。在延胡索二酰乙酰乙酸水解酶缺陷的小鼠(FAH knockout mice)上进行的移植实验证明肝细胞可以复制70次以上[13]。体外培养的成熟肝细胞在一定条件下可以表达间叶、神经、造血的前体标志，表明成熟肝细胞具有分化潜能(图2) [14]。

1.1.3胎肝干细胞

胎肝干细胞具有很强的集落形成能力，在适当培养条件下维持长时间的增殖。在联合免疫缺陷小鼠体内可分化为成熟肝细胞[15] 选用来自水囊引产患者的5月龄胎儿肝脏细胞，诱导肝干细胞分化，有Albumin和CK19的表达，这说明从人胎肝中分离的细胞可能有干细胞[16]。

1.2 非肝源性干细胞

1.2.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞是从哺乳动物的囊胚内细胞群(inner cell mass, ICM)和原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC)分离出来的一种高度未分化细胞，具有自我增殖、更新和分化成动物全身各个种类的细胞的潜能。在特定培养条件下可诱导形成不同的细胞、组织，进一步构建成心、肝、肾等各种组织和器官，最后能形成一个完整的个体。[17]因此利用胚胎干细胞分化得到肝细胞，并将其进行移植从而达到治疗肝病的效果。

胚胎干细胞可自发分化、体外诱导分化和体内诱导分化。

1.2.1.1自发分化

在拟胚体实验[18]中，拟胚体发育过程中内胚层细胞基因的表达模式与小鼠胚胎体内发育过程相似。拟胚体本身可以提供肝细胞分化的微环境[19]，在诱导分化后可以检测到成熟肝细胞的标志，但的胚胎干细胞自发分化得到的大多是一些细胞混合体，分化程度较低，因此有要做进一步的分离。[20]

1.2.1.2体外诱导分化

体外诱导分化研究的挑战在于在体外控制干细胞分化的各种细胞间的信号转导通路。现阶段体外诱导的方法[21]有多种，例如：细胞外基质诱导，与已分化的体细胞进行共培养，基因调控干细胞分化等。细胞外基质诱导一般是指通过提供目的细胞分化、增殖和成熟的微环境从而实现对特定目的细胞的增殖及筛选。与体细胞进行共培养或将胚胎干细胞暴露在已分化的肝细胞胞质浓缩提取液时，不同类型的细胞紧密接触，促进使细胞分化的信号分子之间能够更有效的转导。干细胞通过转染外源基因，使得可以表达特定蛋白质和生长因子。该方法的优点是，这样的构造细胞的同时也纳入标记基因，将使其更易于纯化和扩大细胞在体外的转染。

1.2.1.3体内诱导分化

Choi[22]将胚胎干细胞注入免疫缺陷的小鼠的脾脏内，结果形成了畸胎瘤，这些畸胎瘤的组织中就含有典型形态的肝细胞，并且可以检测到这些细胞可以表达肝细胞特定的蛋白。也有实验表明将体外培养的胚胎干细胞移植到肝脏受到损伤的小鼠体内后，移至的细胞与原来的细胞联合到一起，形成连续的肝索结构。[23]

1.2.2 骨髓干细胞

目前研究发现，骨髓干细胞至少包括两种类型干细胞：造血干细胞（hematopoietic stme cells，HSC）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）。它们在特定条件下可分化成不同种类的细胞，如肝细胞、神经细胞、心肌细胞和骨骼肌细胞等。[24]

造血干细胞可分化为所有种类的组织细胞，虽然骨髓性造血干细胞可分化为肝细胞修复损伤的肝细胞组织，但造血干细胞不是肝干细胞的主要来源，其在肝损伤的修复和再生过程中的作用有限。[24]

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）在不同的理化环境和细胞因子的诱导下可分化为神经细胞、肌肉细胞、骨组织细胞、肝实质细胞等其他组织细胞。[24]已有实验证明间充质干细胞可以向成熟肝细胞定向分化，并可以增殖。[25]但是，然而骨髓间充质干细胞分化是否仅发生在受损的肝脏内也存在争议，实验结果表明间充质干细胞源性的肝细胞占总肝质量的1%不到。[26-27]虽然现阶段未完全研究清楚，但有充足的骨髓间充质干细胞的资源，临床医疗时可以自体取材，经体外诱导后再植入体内无免疫排斥反应，并且可以稳定增殖，在临床应用上具有良好未来。[24]

1.2.3 胰腺上皮干细胞

有研究表明，从大鼠胰腺分离的上皮祖细胞被移植到大鼠肝脏后，该细胞被检测出分化成了肝细胞。[24] 在体外实验中，将胰腺细胞系AR42J-B13移植到含有dexamethasone (Dex)的培养基的肝细胞中培养，检测出肝细胞特定的表达物质：细胞色素P450s CYP3A1、CYP2B1/2、UDPGT和芳基磺基转移酶等。[28]

2 肝干细胞移植治疗肝脏疾病的优势和存在的问题

2.1 肝干细胞移植治疗肝脏疾病的优势

干细胞移植相对于器官移植有着无可比拟的优点。首先，肝干细胞移植可采用自体移植，因此可以避免移植后的排斥反应，同时避免了因排斥反应的服药；第二，肝干细胞具有增殖能力，因此可以移植到体内增殖并且修复受损肝细胞组织。而肝细胞移植仅仅只能替代了病人坏死的肝细胞，其本身可能不具备增殖分化的能力。因此，肝细胞移植仅仅只能帮助病人度过危险期，等待病人肝脏自发再生。[29]最后，肝干细胞移植可以降低肝脏疾病治疗的医疗费用。由于现阶段治疗方法有限，对于器官的需求十分大，肝源数量有限十分珍贵，并且治疗费用十分高，相反，干细胞移植代替器官移植可以减少大量治疗费用的支出。

虽然干细胞治疗各种肝脏疾病的曙光就在眼前，但目前对于干细胞移植的研究仍然有许多问题有待解决，其中主要问题是还没有找到一种完全有效的纯化鉴别卵圆细胞或肝干细胞的方法，并且可以在体外培养足够数量的肝细胞用于临床治疗。[15]

2.2 肝干细胞的分离纯化培养存在的问题

目前，肝干细胞分离提纯的难度较高，得率较低，仍然需要继续探索体外培养的最佳条件。应更进一步研究诱导过程中肝干细胞的特定标志物在基因的表达、蛋白质水平的改变，并且逐渐发现改变培养基与细胞得率之间的关系，从而选择最适合促进肝干细胞生长的环境和方法。[3]

2.3 肝干细胞移植存在的问题

体外诱导干细胞分化成肝细胞的目的是用于临床治疗，因此肝干细胞的移植也是现阶段需要解决的问题。现阶段尚未解决的细胞移植的问题包括：移植细胞的状态，移植数量以及动态观察移植细胞在体内的变化过程等问题。[3]

2.3.1 移植时机

现在仍然没有明确的实验证明不同来源的肝干细胞移植的最好时机，在细胞分化早期移植，细胞未具备肝干细胞重要标志或功能；在细胞分化晚期移植，其增殖能力已大为降低，移植入肝内则难以改善肝脏功能。[3]

2.3.2 移植数量

肝干细胞移植数量太少，在肝内难以发挥作用；移植数量太大，又面临血管阻塞等危险。要得到适当的移植数量还需要大量临床前研究来摸索最适合人类肝内移植的细胞数量。[3]

2.3.3 细胞移植后肝内定位跟踪

干细胞移植体内以后的分化增殖、细胞功能状态尚缺少同步动态的监测手段。目前，最常用的体内移植细胞示踪剂多为荧光物质，例如绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，但无法动态地观察移植的细胞在体内的变化，因此不适合未来临床的应用。所以一种标记效率高的示踪剂的寻找成为细胞移植研究的一个重要方向。[3,29]

3 肝干细胞与肝癌的关系

干细胞和肿瘤细胞都可以无限增殖，而干细胞在体内分化的通路并没有研究得很清楚，因此也无法确切地区分肿瘤细胞和干细胞。近期的研究主要支持肝癌干细胞来源于正常肝干细胞转化的假说。[30]肝癌细胞表达了肝干细胞表面的标志蛋白，说明肝癌细胞可能与肝干细胞有密切联系。[31]考虑肝干细胞可能转化为肝癌细胞这样的不安全因素，同时移植治疗的临床疗效的提高，对于干细胞移植还需要更深入的研究。

4 小结

干细胞移植一旦成功应用于临床将解决医学上的一大问题。虽然应用肝干细胞治疗肝硬化门静脉高压症等难治性肝病的研究尚处于初始阶段，但干细胞自身可无限增殖、在体外可诱导分化的特性以及较强的修复能力都可看出干细胞的应用前景十分广阔。[32]总之，肝干细胞移植为难治愈的肝脏疾病的治疗提供了一个新思路，相信随着对肝干细胞研究的不断深入，肝干细胞移植将成为可能。

参考文献

[1]KONIG S, KRAUSE P,MARKUS PM, et al. Role of stem cells in adult hepatic regeneration [J]. Chirurg,2005,76(5):445-452

[2]徐桂娟,吴云海,颜迎春等.肝干细胞移植在肝病治疗中的应用. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research. March 5,2010 ,Vol.14,No.10:1866

[3]陈积圣,商昌珍. 肝干细胞移植及其应用前景.新医学,2008年11月第39卷第11期：704-705

[4]吕国悦,张平,李红等. 肝干细胞-卵圆细胞的研究进展. 吉林大学学报(医学版),2006年11月第32卷第6期：1134

[5]Sakamoto T, Liu Z, Murase N, et al. Mitosis and apoptosis in the liver of interlukin-6-deficient mice after partial hepatectomy[J]. Hepatology, 1999, 29 (2): 403-411.

[6]Pertersen BE. Hepatic“stem”cells: coming full circle[J].Blood cellsMolDis,2001, 27(3): 590

[7]Roskams TA, Theise ND,Balabaud C, et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers.Hepatology,2004,39:1739-1745

[8]Erker L, Grompe M. Signaling networks in hepatic oval cell activation. Stem Cell Research, 2008, 1:93

[9]Lazaro CA, Rhim JA, Yamada Y, Fausto N. Generation of hepatocytes from oval cell precursors in culture. Cancer Res 1998;58:5514-5522

[10]Daheva MD, Shafritz DA. Activation, proliferation, and differentiation of progenitor cells into hepatocytes in the D-galactosamine model of liver regeneration. Am J Pathol 1993;143:1606-1620

[11]Paku S, Schnur J, Nagy P. Thorgeirsson SS. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol 2001;158:1313-1323

[12]吴燕. 肝干细胞分析研究进展.微生物学免疫学进展.2010年第38卷第2期：82

[13]Fausto N. Liver regeneration and repair hepatocytes, Progenitor cells, and stem cells. HEPATOLOGY, 2004; 39(5):1477

[14]Koenig S, Krause P ,Drabent B, et al. The expression of mesenchymal, neural and haematopoietic stem cell markers in adult hepatocytes proliferating in vitro. Journal of Hepatology, 2006, 44: 1115-1124

[15]徐桂娟,吴云海,颜迎春等.肝干细胞移植在肝病治疗中的应用. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research. March 5,2010 ,Vol.14,No.10:1866

[16]王小平, 陈瑞芬, 宋爱利等. 人胎肝干细胞的体外诱导分化.陕西医学杂志,2003年3月第32卷第3期：197

[17]商昌珍,陈积圣,陈亚进. 胚胎干细胞定向分化为肝脏细胞的研究进展.国外医学外科学分册.2005年9月第32卷第5期:331

[18]Abe K, Niwa H, Iwase K et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Exp Cell Res, 1996,229(1): 27-34

[19]Yamada T, YoshikawaM, Kanda S et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte-like cells identified by cellular uptake of indocyanine green. Stem Cells, 2002,20(2): 146-154

[20]周庆军, 邵健忠, 项黎新等. Advances in the Research of Differentiation of Embryonic Stem Cells into Hepatocyte. Chinese Journal of Biotechnology,2005,21(2):172-176

[21]Heng BC, Cao T, Haider HK et al. An overview and synopsis of techniques for directing stem cell differentiation in vitro. Cell Tissue Res, 2004,315(3): 291-303

[22]Choi D, Oh HJ, Chang UJ et al. In vivo differentiation of mouse embryonic stem cells into hepatocytes. Cell Transplant, 2002,11(4): 359-368

[23]Yin Y, Lim YK, Salto-Tellez M et al. AFP(+), ESC-derived cells engraft and differentiate into hepatocytes in vivo. Stem Cells,2002,20(4): 338-346

[24]何文艳. 肝干细胞的基础及应用研究. 热带病与寄生虫学,2008年第6卷第1期:54

[25]范敬静，李东良，何秀华.骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化.中国组织工程研究与临床康复.2011,15（14）:2491-2494

[26]Long J D, Hong Y L, Li X G et al. The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on hepatic cirrhosis. Stem Cell Research (2009) 2:16–25

[27]Chamberlain J, Yamagami T, Colletti E et al. Efficient Generation of Human Hepatocytes by the Intrahepatic Delivery of Clonal Human Mesenchymal Stem Cells in Fetal Sheep. HEPATOLOGY, 2007,46(6):1935-1944

[28]Dabeva MD, Hwang SG, Vasa SR et al. Differentiation of pancreatic epithelial progenitor cells into hepatocytes following transplantation into rat liver. Proc Natl Acas Sci USA, 1997,94(14):7356-7361.

[29]蔡俊鹰,王教学. 肝干细胞移植治疗终末期肝病的研究进展.安徽医学，2009,30（11）：1362-1364

[30]高强. 肝干细胞的研究进展.实用肝脏病杂志.2008,11(2):124-127

[31]LEE JS,HEO J,LIBBRECHT L, et al. A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells[J].Nat Med,2006,12 (4):410-416.

[32]李志峰. 肝干细胞移植治疗肝脏疾病的研究进展. 外科理论与实践,2008,13(2):181-183