一株具有抗菌活性红树林土壤放线菌的分离和鉴定

摘要：分离和鉴定具有抗菌活性的红树林土壤放线菌。基于形态特征、生理生化特性和１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析，研究通过稀释分离法从广西北海红树林的高盐泥样中分离到１株细菌。系统进化分析表明，分离菌株与链霉菌属Ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｓ ＡＹ９９９７７３具有９９％的同源性，因此，ＢＨ０９５１初步被鉴定为链霉菌属Ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｓ ＡＹ９９９７７３的变种。说明放线菌ＢＨ０９５１具有抗菌活性，本研究能为本菌株乃至广西北海红树林的微生物资源的开发和利用提供初步数据。

关键词：放线菌；链霉菌属；抗菌活性；１６Ｓ ｒＤＮＡ；系统发育分析

中图分类号：Ｓ１５４．３８＋４，Ｑ９３９．１３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）04－0734-03

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Mａｎｇｒｏｖｅ ｓｏｉｌ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ｗｉｔｈ Aｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ Aｃｔｉｖｉｔｙ

ＨＵＡＮＧ Ｄａ－ｌｉｎ，ＹＵＡＮ Ｇｕｉ－ｆｅｎｇ，ＸＵ Ｙａ－ｊｕａｎ，ＬＵＯ Ｎａｉ－ｘｉａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｊｉａｎ－ｈｏｎｇ，ＬＩＵ Ｊｉｎｇ，

ＪＩＡＮＧ Ｌｉａｎ－ｘｉｕ，ＣＨＥＮ Ｓｅｎ－ｚｈｏｕ

（ＴＲＳ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｌｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｌｉｎ ，５４１００４， Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ｓｐ. ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｍａｎｇｒｏｖｅ ｓｏｉｌ were proceeded． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ， ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ， ａｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｓａｌｔ－ｈｉｇｈ ｓｏｉｌ ｆｒｏｍ Ｂｅｉｈａｉ ｍａｎｇｒｏｖｅ ｆｏｒｅｓｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｅｄ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｗａｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｓ ＡＹ９９９７７３ ｗｉｔｈ ９９％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ． Ｓｏ， tｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｏｎｅ variety ｏｆ Ｓ．ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｓ ＡＹ９９９７７３． Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＢＨ０９５１ ｗａｓ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ａｎｄ ｔｈｕｓ it ｗｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｄａｔａ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｉｔｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＢＨ０９５１ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ aｃｔｉｎｏｍｙｃｅteｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｎｇｒｏｖｅ ｆｏｒｅｓｔ ｓｏｉｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂｅｉｈａｉ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ； Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ； aｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ； １６Ｓ ｒＤＮＡ； pｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ

自抗生素发现以来，微生物来源的药物随着人们的需求在不断地增加，近年来海洋微生物资源研究成为科学界关注的热点领域之一。海洋环境属于地球上最大的盐环境，由于其环境的多样性，使得海洋微生物具有其特殊的生理机制和独特的基因类型，具有产生新的生物活性物质的巨大潜力，因而向海洋微生物寻求药用物质和药物先导化合物成为各国的重点研究方向［１-３］。广西拥有丰富的红树林资源，红树林是自然分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落，生存环境处于海洋向陆地的过渡带，有着不同于陆地的性质，水分高、盐分高、氧气缺乏。其地下部分的微生物较之其他生态系统有很大的差异，这就赋予了红树林土壤微生物产生活性物质的潜在可能性。２００９年７月，从广西北海红树林根部泥样中分离得到一株放线菌ＢＨ０９５１，其发酵产物对金黄色葡萄球菌（Ｓ． ａｕｒｅａｓ）、大肠杆菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、变形杆菌（Ｐ． ｖｕiｇａｒｉｓ）等病原微生物有很强的抗菌活性，具有从中开发微生物药物的潜力。通过对其１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析，结合形态特征、培养特征、生理生化特性等多相分类研究，初步确定了该菌株的分类地位。现将研究结果报道如下。

１材料

菌种分离自广西北海红树林根部土壤海泥标本，用海水配制高氏１号琼脂，采用稀释分离法将所采集的样本进行分离纯化，经筛选共获得放线菌菌株２５６株。对其进行初步抑菌活性测定，得到１株具有很好开发潜力的菌株（编号ＢＨ０９５１），菌株分离及筛选方法参见文献［４］、［５］、［６］、［７］。抗菌活性测定所用指示菌由本实验室保藏。

高氏１号培养基（可溶性淀粉２．０％、ＫＮＯ３ ０．１％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０５％、ＭｇＳＯ４ ０．０５％、ＦｅＳＯ４ ０．００１％、重铬酸钾０．０１％，调节ｐＨ值至７．２～７．４）。抗生素药敏纸片、培养皿、载玻片、盖玻片等。

超净工作台，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌器，Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ－２光学显微镜，Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ－３０扫描电子显微镜。

２方法

２．１形态观察和培养特征

将ＢＨ０９５１菌株用高氏１号琼脂埋片培养，２８℃培养１０ ｄ，观察并记录培养菌落特征。取埋片用Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ－２光学显微镜高倍镜观察菌丝体形态。扫描电子显微镜样品的制备，放线菌的孢子含水量低且不易变形，可以不经固定和干燥，采用离子溅射镀膜机喷镀金属，可获得均匀的细颗粒薄金属镀层，在较低加速电压下直接观察，提高扫描电子图像的质量。用Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ－３０扫描电子显微镜放大２万倍，观察孢子丝及孢子形态。

２．１抗菌活性试验

参照医学药敏试验方法进行，采用纸片琼脂扩散法［８］，选择一些标准菌株进行抗菌活性试验，如大肠埃希菌ＡＴＣＣ２５９２２、铜绿假单胞菌ＡＴＣＣ２５９２２、金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２５９２３等，用Ｍ－Ｈ培养基培养菌株，菌液浓度为０．５麦氏单位，测定ＢＨ０９５１菌株摇瓶发酵液抗菌活性，用１０ μｇ／ｍＬ的链霉素做阳性对照，培养１６～１８ ｈ后，测量抑菌圈的直径大小。

２．３生理生化特性

生理生化特征和细胞化学特征按文献［９］、［１０］所用的方法进行。

２．４１６Ｓ ｒＤＮＡ序列测定和系统发育分析

放线菌基因组总ＤＮＡ的提取采用酶法提取，１６Ｓ ｒＤＮＡ序列的ＰＣＲ扩增方法，使用以下两个通用引物：Ｐｒｉｍｅｒ Ａ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ

－３′；Ｐｒｉｍｅｒ Ｂ：５′－ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ－３′（上海生工生物工程有限公司合成）。反应条件：９４℃预变性５ ｍｉｎ；９５℃ １ ｍｉｎ，５８℃ １ ｍｉｎ，７２℃ ３ ｍｉｎ，共３０个循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ。扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳得到一条１ ５００ ｂｐ左右的条带，ＰＣＲ产物送上海生工公司测序［４］。测序结果先利用Ｂｌａｓｔ软件从ＧｅｎＢａｎｋ数据库中调出相关的放线菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ 序列，用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ１．８３软件包排序，随后用ＭＥＧＡ ４ 软件进行序列分析，采用Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ法进行系统发育树的构建和同源性比较。

３结果与分析

３．１形态特征

ＢＨ０９５１在高氏１号培养基上生长良好，菌落表面呈粉绒状凸起，并带有明显褶皱，菌落最初为白色，随后慢慢变成灰色或灰白色，菌株在培养基上产生金黄色可溶性色素。该菌株气生菌丝发育良好，成熟后生成孢子丝，孢子丝直至螺旋状，基内菌丝丰富，多分支，不断裂（图１）。电镜扫描结果显示ＢＨ０９５１菌株孢子链长，分化为孢子，孢子圆形至卵圆形，表面光滑（图２）。以上特点与链霉菌属特征吻合。

３．２菌株的抗菌活性

抗菌试验结果见表１。以链霉素做阳性对照，抑菌圈直径在质控控制范围内，试验的结果有效。结果表明，ＢＨ０９５１发酵液对金黄色葡萄球菌（Ｓ． ａｕｒｅａｓ）、大肠埃希菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、表皮葡萄球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、普通变形杆菌（Ｐ． ｖｕiｇａｒｉｓ）等原核病原微生物有很好的抑制作用，但对铜绿假单胞杆菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、白假丝酵母菌（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）等真核微生物没有抑菌活性。铜绿假单胞杆菌是一种天然耐药菌，对多种药物都存在抗药性；假丝酵母菌为真核细胞型微生物，细胞结构与细菌细胞存在差异有关。

３．３生理生化特性

ＢＨ０９５１菌株能液化明胶、水解淀粉、水解纤维素、牛奶凝固而不胨化；不产生硫化氢、不还原硝酸盐；可利用葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、甘露糖、蔗糖、肌醇、甘油作为碳源生长，不能利用棉子糖、阿拉伯糖、鼠李糖、天冬氨酸。这些结果与链霉菌属特征相符。

３．４基于基因序列的系统发育分析

测得菌株ＢＨ０９５１的基因１６Ｓ ｒＤＮＡ核苷酸序列全长为１ ４８９ ｂｐ，其１６Ｓ ｒＤＮＡ序列已登陆ＧｅｎＢａｎｋ，序列号为ＧＵ２６５７２０，用Ｂｌａｓｔ软件从ＧｅｎＢａｎｋ等数据库中进行序列相似性搜索，ＢＨ０９５１菌株与Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｓ ＡＹ９９９７７３菌系统发育关系最密切，相似度为９９％，与其以很高的基因序列相似性在系统发育树状图中以极高的自展值，支持聚在一起。一般情况下，１６Ｓ ｒＤＮＡ 序列同源性为９８％以上的可以认为是新菌株，９６％～９７％的可以认为是新种，９３％～９５％的可以认为是新属［９］。综合形态学特征、培养特征、生理生化特征等在内的多相分类结果，认为ＢＨ０９５１菌株可以被初步鉴定为链霉菌属的Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｓ ＡＹ９９９７７３的变种（图３）。

４小结与讨论

根据以上形态特征、培养特征、生理生化特性和系统发育分析的研究结果，这些结果与链霉菌属特征相符，ＢＨ０９５１菌株具有链霉菌属菌株典型的特征，属于链霉菌属。菌株分离来自广西北海红树林根部高盐泥样，生长需要一定浓度的盐，为微嗜盐菌，具有很强的抗菌活性，进行分离与鉴定旨在为该菌株的后续研究与开发奠定一定的基础，从中开发微生物药物。

链霉菌属菌株具有丰富的物种多样性和代谢类型多样性，是极其重要的产生天然活性产物的微生物资源。自２０世纪６０年代至今发现的１２ ０００余种微生物来源的新生理活性物质中，５５％以上是由链霉菌属菌株产生的。目前临床上应用的抗生素约２／３来源于链霉菌属，该属产生的生物活性物质还包括抗肿瘤剂、免疫抑制剂、抗虫剂等［１１］。但随着已经发现的微生物源化合物数量的增加，从普通环境中分离筛选新的活性物质产生菌的难度日益上升，如何使用更独特的分离方法、从更多样的环境尤其是极端环境中分离筛选活性菌株，成为当前微生物资源开发利用的重要研究课题［１２］。本试验研究结果表明，分离自海洋红树林环境中的链霉菌属菌株ＢＨ０９５１能产生具有较强抗菌活性的代谢产物，说明海洋环境中的链霉菌同样是重要的活性天然产物产生菌资源。

致谢：复旦大学微生物和微生物工程系钟江教授，化学系扫描电镜室提供很多的帮助，谨致谢意。

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