黏液型铜绿假单胞菌感染实验鉴定和病例回顾分析

摘要：铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，Pa）在由各种原因所致的人体抵抗力低下时引起皮肤感染、呼吸道感染、泌尿道感染、烧伤感染等，亦可导致菌血症、心内膜炎、囊性纤维变性，该菌引起的慢性肺部感染占有较大的比例。其临床表型分为黏液型及非黏液型。黏液型铜绿假单胞菌（mucoid pseudomonas aeruginosa，mPa）与非黏液型在生长特点、致病性及药物敏感方面均存在差异。现对我院分离的一株mPa进行回顾性分析，以此为临床诊疗提供一些帮助。

文章编号：1673-8640（2018）-0107-02

中图分类号：R56

文献标志码：B

实验室鉴定

一、研究对象临床微生物室分离的一株mPa，药敏试验同时采用纸片琼脂扩散法（K-B法）和肉汤稀释法（MIC法），作对照比较。

二、试剂和仪器深圳迪尔DL-96细菌测定系统及其提供的NE鉴定板条，普通公司的MH肉汤和MH琼脂平板，英国OXOID公司生产的药敏纸片，质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923均购自湖北省临检中心。

三、方法

1.菌株鉴定及药敏试验取病患留取的晨痰做涂片和接种哥伦比亚血平板、含万古巧克力平板（三区划线），痰涂片一张行革兰氏染色，一张行萋-尼抗酸染色。镜检为合格痰（上皮细胞<10个/LP，白细胞>25个/LP），未发现抗酸阳性杆菌。平板在35℃、C02孵箱培养24h后观察，均长出水滴样菌落，在血平板的第三区，水滴样菌落>5个，半定量判定为4+，具有临床意义。取巧克力平板上水滴样菌落分纯，第二天做氧化酶试验：阳性。刮取黏液型菌落接种于营养肉汤，35℃孵育5h后，调节菌液浓度至0.5麦氏单位，按照试验要求接种迪尔公司提供的NE板条；无菌棉拭子蘸取MIC法多余的药敏液接种MH平板，贴药敏纸片。35℃孵育48h判读结果。

2.结果48h后，利用迪尔DL-96细菌测定系统判读为铜绿假单胞菌（P：99.58），两种方式的药敏结果如下（以2017年更新的CLSI为判讀标准）：

3.比较发现哌拉西林、头孢他啶的药敏结果不相符，美罗培南的K-B抑菌圈直径过大（标准菌株ATCC27853对美罗培南的抑菌圈直径为27～33mm）。查阅文献资料，《临床微生物学手册》有如下表达：一项对597株分离自囊性纤维化患者的细菌的研究表明，纸片扩散法和Etest法作为常规敏感性试验方法通常是可以被接受的；然而，使用扩散法检测黏液型细菌对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦和美罗培南的药物敏感性结果相关性较差；纸片扩散法比Etest法更容易漏检细菌耐药性，尤其对头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦进行测试时。这一实验室现象值得临床微生物工作人员关注和探讨。黏液型铜绿假单胞菌（mPa）在临床上时有分离，由于mPa生长缓慢，在微量肉汤稀释法药敏试验中，24小时往往生长不能达到一定浊度，导致仪器误判为敏感。人们更愿意选用孵育时间可延长的自动化系统，迪尔的鉴定板条可自主选择孵育时间，刚好可以满足这一条件。

病例资料

患者，女，77岁。患者于6年前渐起咳喘，呈进行性加重，曾多次在本院住院治疗，诊断为支气管扩张症。约10余天前，上述症状再发加重，于2017.11.29收治入院。11.30检查：白细胞13.54×109/L，中性粒82.9%，CRP：68.2mg/L.肺部CT显示 双肺纹理增多、杂乱、增粗，其内见多个小囊柱状影；双肺见多个小结节影及小斑片影。影像学诊断：双肺支气管扩张合并感染，慢支、肺气肿。医生经验性使用头孢哌酮/舒巴坦2g、q12h，阿奇霉素0.5g/d滴注。12.4号痰培养提示黏液型铜绿假单胞菌生长，药敏结果如图1。医生改用头孢哌酮/舒巴坦2g、q12h联合阿米卡星0.6g/d治疗。12.13结合患者鼻窦CT：双侧上颌窦、双侧筛窦、左侧碟窦炎症，医生诊断为弥漫性泛细支气管炎（DPB）合并黏液型铜绿假单胞菌感染。处方改为头孢哌酮/舒巴坦3g、q12h，庆大霉素20万单位/日滴注，口服罗红霉素0.15g/d联合治疗，同时给予祛痰剂、皮质激素的对症支持治疗，治疗效果良好，12.22患者病情好转，主动要求出院，院外遵医嘱继续小剂量口服罗红霉素至6个月以上。

讨论

临床上将与生物被膜有关的疾病总称为生物被膜病，如肺囊性纤维化（CF）、弥漫性泛细支气管炎（DPB）、亚急性细菌性心内膜炎、慢性骨髓炎、感染性肾结石等。大多数呼吸道生物被膜病为DPB和支气管扩张症，另一部分为CF合并感染和慢性支气管炎，其致病菌主要为铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌。生物被膜内细菌分泌的多糖蛋白复合物被膜所形成的屏障阻止了抗生素的穿入，保护细菌逃逸抗生素的杀灭作用，同时处于被膜包裹中的细菌不易获得氧气和养分， 处于低代谢甚至休眠状态，对抗菌药物不敏感；另一方面黏液型细菌的胞外多糖具有干扰正常宿主吞噬防御和促进生物膜形成的能力，造成这些细菌以生物被膜的形式长期存活于病人的下呼吸道，有时表现为炎症急性发作，有时呈亚临床状态。而且生物被膜中的硅酸盐具有抗原性，刺激机体产生抗体，在机体内形成免疫复合物，造成机体免疫损伤。故生物被膜病常常呈现为难以治愈。

陈迁等报道，通过体外试验发现，罗红霉素能抑制铜绿假单胞菌多糖蛋白复合物合成。现在有很多实验研究也发现十四、十五元环的大环内酯类抗生素能抑制硅酸盐的合成，破坏生物被膜的结构，能显著提高抗菌药物对生物被膜的渗透能力，增强其杀菌作用。临床实践也证实：长期、小剂量应用红霉素能使CF患者的5年生存率提高60%。因此普遍观点认为，治疗mPa感染时，应根据药敏试验结果选择敏感药物联合一种大环内脂类药物使用。报道最多的是罗红霉素、红霉素、克拉霉素，阿奇霉素可能也有同样的效果，但报道较少。当分离出mPa时，临床微生物实验室应在报告单上加以醒目标示，提醒临床医生注意抗菌药物的合理应用。

参考文献

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（收稿日期：2017-06-30）