肠道病毒71型（EV71）的检测

2022-03-11 08:40:44 | 浏览次数：

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[摘要] 目的探讨肠道病毒71型（EV71）的检测方法。方法采用酶联免疫法（ELISA法）、免疫胶体金法（胶体金法）、荧光定量PCR法（PCR法）对1399例手足口病患儿的样本进行检测，并对检测结果进行卡方检验。结果 1399例手足口病患儿样本ELISA法、金标法、PCR法结果的阳性率分别为37.8%、36.0%、39.8%，三种方法检验结果无显著性差异（χ2=4.197，P>0.05）。ELISA法与胶体金法及PCR法结果比较均无显著性差异（χ2=0.959，P>0.05；χ2=1.180，P>0.05）；胶体金法与PCR法两者之间差异有统计学意义（χ2=4.26，P<0.05）。结论这三种肠道病毒71型（EV71）检测方法无显著差异，但胶体金法方便快捷，PCR法精准，ELISA法可作为常规使用。

[关键词] 肠道病毒；EV71；胶体金法； ELISA；PCR

[中图分类号] R446.6；R450 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）20-0093-03

Detection of enterovirus 71 （EV71）

ZHANG Xianhua

Laboratory Department， the Fifth People"s Hospital of Anyang City in He"nan Province， Anyang 455000， China

[Abstract] Objective To investigate the enterovirus 71 （EV71） detection methods. Methods Samples from 1399 children with hand， foot and mouth disease were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， immune colloidal gold method （colloidal gold method） and fluorescence quantitative PCR method （PCR method）， and the chi-square test was conducted on these detention results. Results The positive rates of samples from 1399 children with hand， foot and mouth disease by the ELISA method， the gold standard method and the PCR method were 37.8%， 36.0% and 39.8%， respectively， without significant difference（χ2=4.197， P>0.05）. The colloidal gold method and the PCR method had no significant differences （χ2=0.959， P>0.05； χ2=1.180， P> 0.05）. The colloidal gold method and the PCR method， had significant difference between the two methods （χ2=4.26， P<0.05）. Conclusion There is no significant difference among the three enterovirus 71 （EV71） detection methods. But the colloidal gold method is more convenient， and the PCR method is more precise. ELISA method can be used for routine detection.

[Key words] Enterovirus； EV71； Colloidal gold method； ELISA； PCR

肠道病毒71型（EV71）是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒。可经肠道（粪-口途径）传播，也可经呼吸（飞沫、咳嗽、打喷嚏等）传播，亦可因接触患者口鼻分泌物、皮肤或黏膜疱疹液及被污染的手及物品等造成传播。以5岁及以下儿童为主，尤以3岁以下的儿童发病率最高。EV71感染可导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎、肺炎、心肌炎等症状或并发症，严重者可导致死亡[1-3]。所以探寻一个快速、准确的检测方法十分必要。我科为此对1399例手足口病患者的样本分别采用ELISA法、胶体金法、PCR法进行检测，并将检测结果进行统计学分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1399例手足口患儿均来自我院2014年4月1日～9月30日住院患者，诊断符合2012年国际手足口病会议关于手足口病诊断标准[4]，其中男887例，女512例；平均年龄2.8岁。标本ELISA法、胶体金法用普通真空负压管采集静脉血后，分离血清；PCR法用无菌咽拭子采集患儿咽峡部黏膜疱疹液。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器 SLAN-96P全自动医用PCR分析系统，上海宏石医疗科技有限公司；RT-2100C酶标分析仪、RT-2600C全自动洗板机，深圳雷杜生命科学股份有限公司。操作由专业技术人员严格按操作规程操作。

1.2.2 试剂胶体金法肠道病毒71型IGM抗体检测试剂盒，北京新兴四环生物技术有限公司；ELISA法肠道病毒71型抗体（IGM）检测试剂盒，北京贝尔生物工程有限公司；PCR法肠道病毒71型核酸检测试剂盒，湖南圣湘生物科技有限公司。

1.3方法

①胶体金法：采用胶体金免疫层析技术原理[5]，在金标垫上包被胶体金标记的鼠抗人IgM。用于定性检测全血、血清或血浆样品中的肠道病毒71型IgM抗体（EV71-IgM）。检测阳性样品时，样品中的肠道病毒71型IgM抗体可与胶体金标记的鼠抗人IgM结合，形成免疫复合物，由于层析作用复合物及样品在硝酸纤维素膜内部向前流动，当复合物经过T线时与包被的重组EV71-Ag结合，形成“Au-鼠抗人IgM- EV71-IgM-EV71-Ag”而凝集显色、剩余的胶体金标记的鼠抗人IgM与C线处包被的羊抗鼠IgG抗体结合而凝集显色，检测阴性样品时，样品中不含肠道病毒71型IgM抗体，致使不能形成免疫复合物，则只能在C线处显色。②ELISA法：采用捕获法原理检测人血清或血浆样品中肠道病毒71型IgM抗体（EV71-IgM），微孔中预包被鼠抗人IgM（μ链）。首先加入待检标本的血清或血浆样品后，样品中的IgM抗体都可被捕获，未结合的其他成份（包括特异性的IgG抗体）将被洗涤除去；第二步：加入肠道病毒71型抗原标记酶，被捕获的IgM中的EV71-IgM会与辣根过氧化物酶标记的EV71重组抗原特异性结合，洗去其他未结合物，最后加底物TMB显色，通过酶标仪检测吸光度（A值）从而判定样品中的EV71-IgM抗体的存在与否；③PCR法：在体外模拟病毒核酸的复制过程，针对EV71核酸保守区设计特异性引物和特异性荧光探针，配以RT-PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现EV71-RNA的快速检测；其检测体系中含有阳性内对照（内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性；通过与标准曲线比对得出定量结果。

1.4统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件，计数资料比较应用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

1399例手足口病患儿的样本分别采用ELISA法、胶体金法、PCR法进行检测，其肠道病毒71型检测结果见表1。ELISA法与胶体金法、PCR法比较均无显著性差异（χ2=0.959，P>0.05；χ2=1.180，P>0.05）；胶体金法与PCR法比较，两者之间差异有统计学意义（χ2=4.26，P<0.05）。

3讨论

目前随着检验医学的快速发展，相关的检验技术也得到了不断提高，检验方法也层出不穷，检测的准确性、灵敏度也大大增加；病毒的检测方法也从血清学发展到分子生物学检测。肠道病毒71型（enterovirus71，EV 71）作为引起手足口病（hand foot mouth disease， HFMD）的最常见病毒，不仅可引起患儿发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，还可引起个别患者心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症；更是重症患儿的原凶[4，6-10]。近年手足口病流行，国家疾控部门非常重视，其检测技术也更加完善齐全。

胶体金免疫技术（colloial gold immunoassay）是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术[11]。金标法是国际上较为先进的、灵敏、特异、快速、简便、准确率高的体外诊断方法。测定结果仅凭特制的检验盒在短时间内即可获得。

ELISA技术将抗原抗体反应的特异性与酶高效催化底物的敏感性结合，反应在固相上进行，便于洗净对试验有干扰的非特异无关物质，操作快速简便，可定性也可定量报告结果，适于大批量标本检测；其凭借高度的敏感性和特异性、操作简便以及试剂稳定、对环境没有污染等特点，目前仍是临床常规、科研工作的重要技术手段之一[11-12]。手足口病抗体检测的最常用方法仍是血清学试验、血清中和实验及酶联免疫法；该方法精确且具有型特异性。LMB组合血清可大大简化鉴定过程，但是有些毒株的中和作用不稳定，仍需由单价血清来鉴定，另一要注意的是病毒颗粒的集聚会影响中和效果，如EV71的中和实验就需要使用单个分散的病毒。而ELISA法相比而言操作简便，可大批量自动化进行，成本低廉，患者易于接受。

PCR技术是从分子生物学水平直接检测被检病毒自身的遗传物质，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的标准[11]。已成为诊断病毒感染常用的一种方法，是诊断的金标准，但操作专业性强，成本贵，检测费用高，患者难以承受。

由于方法学的局限性，胶体金法的检测结果由人肉眼观察判读，易受目测误差或主观判读等因素影响，因此，当条带颜色不易明确判断时，建议重复检测；胶体金法的检测结果作为诊断的辅助手段之一，检测结果仅供参考，不作为临床诊治的唯一依据，阳性结果需采用其他方法进一步确认。感染初期，IgM未产生或滴度很低会导致金标法和ELISA法结果阴性，应提示患者1～2周内复查，复查时同时平行检测上次采集的标本以确认是否出现血清学阳转或滴度明显升高。对于免疫功能受损或接受免疫抑制治疗的患者，其血清学抗体检测的参考价值有限。应采用单克隆抗体间接免疫荧光法检测病毒抗原、RT-PCR技术检测病毒核酸进行快速诊断[13-14]。

对于金标法和ELISA法其检测样本有一定要求：①静脉采集的样本，无论抗凝或非抗凝标本首先要及时充分离心分离血清或血浆，然后取澄清的液体进行检测，如果末充分沉淀，悬浮的纤维蛋白可引起ELISA法假阳性和影响金标法的检测。②标本中含有EDTA、枸橼酸钠、肝素钠等抗凝剂时，通常不影响实验结果；轻度胆红素、血红蛋白、血脂样本通常不会影响实验结果，但含量过高时则影响检验结果。③乙肝、丙肝、类风湿因子、EB病毒、CMV病毒、风疹病毒等相关疾病通常不会影响实验结果。④血清或血浆样本收集后5 d内检测可4℃冷藏保存，大于5 d检测样本应放置-20℃冷冻保存，且避免反复冻融，最多不超过3次。金标法和ELISA法试剂要根据用量，用多少取多少，用前先让试剂恢复室温；用后及时收起，放置冰箱冷藏。PCR法则要求专业技术人员实验前熟悉和掌握所需试剂和仪器的操作方法和注意事项，对每次试验进行质量控制；严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范和操作规程进行操作，避免交叉污染，确保结果准确无误。

由上述结果可以看出，采用ELISA法、胶体金法、PCR法进行肠道病毒71型检测，其结果差异性不大；各医疗机构可根据不同诊疗目的和人群进行适当选择，检测结果应结合临床检查、病史及其他检测综合分析诊断。

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