微生态制剂对小鼠受损肠道的修复作用

【摘要】 目的：探究微生态制剂对小鼠肠道损伤后的修复作用。方法：将小鼠分5组，每组10只，对1～4组小鼠进行腹腔注射顺铂，1 mL/100 g，造受损肠道模型。然后分别用乳酸菌、功能寡糖、乳酸菌和功能寡糖混合、饮用水（阳性对照）喂养1～4组小鼠，第5组小鼠作阴性对照，常规饲料饲养。2周后比较各组小鼠小肠石蜡切片和离体小肠平滑肌收缩能力。结果：乳酸菌和功能寡糖混合3组，切片观察小肠黏膜细胞排列紧密，小肠平滑肌收缩力最强。结论：乳酸菌与功能寡糖制剂能有效修复损伤后小肠，增强小肠蠕动。

【关键词】 微生态制剂； 功能寡糖； 修复作用

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of microecological preparation on intestinal damaged mice.Method：Divided mice into 5 groups，10 mice in each group，group 1-4 made the model of the damaged intestine mice by intraperitoneal injected cisplatin 1 mL/100 g，and fed with lactic acid bacteria，functional oligosaccharides，lactic acid bacteria and functional oligosaccharides，drinking water（positive control group）respectively，group 5 as negative control.After 2 weeks，the small intestine paraffin sections and the contractility of isolated small intestinal smooth muscle were compared.Result：Intestinal mucosa cells of the mice fed with lactic acid bacteria and functional oligosaccharides（group 3）were arranged closely and the contractility of isolated small intestinal smooth muscle was the strongest.Conclusion：Lactic acid bacteria and functional oligosaccharide can repair small intestine damaged and enhance its peristalsis effectively.

【Key words】 Microecologics preparation； Functional oligosaccharide； Repairing function

First-author’s address：School of Pharmacy Linyi University，Linyi 276000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.007

微生态制剂，是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂[1-3]。也就是说，一切能促进正常微生物群生长繁殖及抑制致病菌生长繁殖的制剂都称为微生态制剂[4-5]。乳酸菌作为重要的益生菌来源，主要通过恢复或增强肠道稳态发挥作用，是一类具有佐剂活性的非病原细菌，并有作为黏膜疫苗载体使用的潜能[6]。其中双歧杆菌是人类肠道菌群中唯一的一种既不产生内毒素又不产生外毒素，无致病性的具有许多生理功能的有益微生物[7]。功能性低聚糖是肠道内有益菌的增殖因子，其中最明显的增殖对象是双歧杆菌，因为双歧杆菌细胞表面具有寡糖的受体，而许多寡糖是有效的双歧因子。本实验主要比较不同组合的几种微生态制剂对受损肠黏膜的修复作用，优化最佳组合方案，以此维护肠道健康，提高患者的生存质量，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 選择同批次的KM小鼠，雌雄各半，体重（28±2）g，购于山东省农业科学院畜牧兽医研究所。

1.1.2 药品及试剂 顺铂（10 mL/支，批号：H37021358）购自齐鲁制药有限公司；低聚异麦芽糖（食品级，纯度：99.8%），购自安徽中南生物科技有限公司；乳酸菌（含双歧杆菌BB-12、保加利亚乳杆菌、嗜热乳链球菌等，产品标准号Q/TZCXG0001）北京川秀科技有限公司。配制

1000 mL台氏液（Tyrode），含：NaCl 8.0 g、10% KCl

2.0 mL（0.2 g）、10% MgSO4·7H2O 2.6 mL（0.26 g）、5% NaH2PO4·2H2O 1.3 mL（0.065 g）、NaHCO3 1.0 g、1M CaCl2 1.8 mL（0.2 g）、葡萄糖1.0 g。（注意：CaCl2溶液须在其他基础溶液混合并加蒸馏水稀释之后，方可一面搅拌一面逐滴加入，否则将生成钙盐沉淀，葡萄糖应在临用时加入，加入葡萄糖的溶液不能久置）。FAA固定液：40%的甲醛溶液5 mL，70%乙醇90 mL，冰醋酸5 mL。

1.1.3 仪器 BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；HHQ-3658电脑组织切片机（金华市华海科教仪器厂）；水浴恒温振荡仪（金坛市亿通电子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 将小鼠分为5组，每组10只，取回后先进行适应性饲养2 d。前4组小鼠进行腹腔注射顺铂，1 mL/100 g，造受损肠道模型。然后分别用乳酸菌、功能寡糖、乳酸菌和功能寡糖混合、饮用水（阳性对照）喂养1、2、3、4组小鼠，第5组小鼠作阴性对照，常规饲料饲养。1周后第4、5组各取2只，脱臼处死取小肠，显微镜观察并进行石蜡切片比较两组不同，判定模型组制备效果。模型制备成功后，实验组分别在饮用水中添加混合菌制剂，混合菌和功能寡糖，功能寡糖。乳酸菌的浓度为104CFU/mL，功能寡糖浓度为5 g/100 mL，2周后处死剩余小鼠并进行小肠石蜡切片和测离体小肠平滑肌收缩力。

1.2.2 小鼠小肠石蜡切片的制备 小鼠用颈椎脱臼法处死，剖腹取出粗细适宜的小肠2～3 cm若干段，修块5 mm×5 mm×2 mm，立即投入生理盐水中，用灭菌注射器吸取少量生理盐水，不断冲洗肠腔直至无任何杂物。立即投入FAA固定液中固定25 min，56 ℃、振速100 次/min恒温振动固定；在37 ℃恒温振荡仪中进行脱水70%、80%乙醇溶液脱水各20 min、95%乙醇溶液Ⅰ、Ⅱ缸脱水各15 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸脱水各10 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ缸透明5 min，65 ℃振动；浸蜡包埋58～60 ℃，15 min，切片，纵切厚度3～4 m，45 ℃水温展开，洁净的载玻片上涂上一层薄薄蛋白甘油，把展开的切片贴在上面，裱好的石蜡切片，60 ℃烤25～30 min；染色：石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ缸各10 min，然后放入无水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各10 min，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇2 min，再放入蒸馏水中1 min[8]。切片HE染色后在显微镜下观察各组小肠绒毛的变化。

1.2.3 小鼠小肠离体平滑肌生理活性测定 取实验后的小鼠，禁食24 h后，用颈椎脱臼法处死。迅速沿腹中线打开腹腔，每只小鼠取十二指肠同一肠段放入盛有混合气体的饱和台式液中，洗净肠内容物。将其剪成2～3 cm的肠段作为实验标本。打开BL-420E生物机能实验系统，调零，定标，在一通道输入接口处安装张力换能器。调节恒温平滑肌槽，使水温保持在（37±0.5）℃，将台式液加入预管内，药物管加入16 mL台氏液。将标本一端固定于L型通气钩上，另一端连接张力换能器，持续通入混合气体（96% O2，4% CO2），气泡1～2个/s，温度37 ℃，待肠管运动稳定后，开始进行实验测定离体小肠平滑肌的频率和振幅。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠小肠石蜡切片观察 图1可以看出小肠黏膜纤毛排列紧密，图2纤毛损伤较为严重。图3基本和正常情况下的小肠切片一致，图4纤毛损伤情况较前一组严重，图5黏膜间出现裂缝，說明有部分组织损伤。说明微生态制剂可以有效修复受损肠黏膜组织。

2.2 各组小鼠离体小肠平滑肌收缩力测定比较 与阴性对照5组比较，1～4组小鼠小肠频率增加的百分比分别是-9%，-22%，6%，-39%，而1～3组与阳性对照4组比较增加的百分比分别是48%，27%，74%，比较差异均有统计学意义（P<0.05），这充分说明乳酸菌与功能寡糖混合可以充分修复被放化疗药物破坏的小鼠小肠，甚至在其修复的基础上增加了其平滑肌的收缩频率，修复小肠的蠕动能力，促进消化吸收。与阴性对照5组比较，1～4组小鼠小肠振幅增加的百分比分别是50%，5%，11%，-56%，而1～3组与阳性对照4组比较，增加的百分比分别是237%，138%，150%，差异均有统计学意义（P<0.05），这说明乳酸菌与功能寡糖混合可以充分修复被放化疗药物破坏的小鼠小肠，在增加其收缩频率的基础上增大其振幅。由此可知微生态制剂可以有效修复小鼠小肠平滑肌振动频率及振幅，促进消化和吸收，见表1。

3 讨论

本实验研究确定由乳酸菌和功能寡糖配制成的微生态制剂对肠黏膜的保护作用效果最佳。究其原因在于乳酸菌细胞、细胞壁成分和胞外分泌物可增强免疫细胞的活性，促使肠道免疫蛋白A（IgA）浆细胞的产生，从而杀灭侵入体内的细菌和病毒，消除体内“病变”细胞，防止疾病的发生及恶化[9-10]。某些功能性低聚糖，如异麦芽低聚糖，摄入人体后到大肠被双歧杆菌及某些乳酸菌利用，而肠道有害的产气荚膜杆菌和梭菌等腐败菌却不能利用，从而保护肠黏膜[11-13]。

近年来，癌症患者与日俱增，放化疗是临床目前治疗癌症主要的方式，但是随着大剂量放化疗在临床应用范围的扩大，所引起的不良反应也越来越明显[14-16]。影响正常组织细胞，引起机体免疫力下降尤其是消化道的损伤，据报道，40%的癌症患者死于营养不良。而微生态制剂能有效修复损伤的小肠，提高小肠的收缩能力，促进小肠的蠕动，从而有效缓解癌症患者的消化不良等问题，并且能调节肠道内菌群平衡，从而大大增加癌症患者的存活率，提高患者生存质量[17-20]。

综上所述，本实验通过化疗药物顺铂制备的肠道受损模型在一定程度上反映了化疗药物引起消化道不良反应的一些特征，并利用外源性的添加部分有益的活菌制剂能在短时间内使得多种菌群的达到均衡。说明在临床长期使用放化疗的情况下，适当补充外源性有益活菌制剂可适当调节肠道菌群的平衡，增强肠道平滑肌收缩功能，有利于疾病的康复。

参考文献

[1] Maroof H，Hassan Z M，Mobarez A M，et al.Lactobacillus acidophilus could modulate the immune response against breast cancer in murine model[J].J Clin Immunol，2012，32（6）：1353-1359.

[2] Rerksuppaphol S，Rerksuppaphol L.Lactobacillus acidophilus andBifidobacterium bifidum stored at ambient temperature are effective in the treatment of acute diarrhoea[J].Ann Trop Paediatr，2010，30（4）：299-304.

[3]周长林.微生物学与免疫学[M].3版，北京：中国医药科技出版社，2013.

[4]艾洪滨.人体解剖生理学实验教程[M].3版，北京：科学出版社，2016.

[5]周长林.微生物学实验与指导[M].3版，北京：中国医药科技出版社，2015.

[6]杜丹，方立超，陈丙波，等.嗜酸乳杆菌合生元对抗生素相关腹泻大鼠肠道菌群和肠黏膜损伤的作用[J].胃肠病学，2009，14（2）：88-91.

[7]赵胜娟，孙文峰，刘爱萍，等.益生菌对肠道微生态影响的研究现状[J].食品研究与开发，2008，29（4）：182-185.

[8]李璐，李琛.制作小肠组织石蜡切片的改进办法[J].解剖学杂志，2014，37（2）：263-264.

[9]窦以志.溃疡性结肠炎应用肠道微生态制剂的效果观察[J].临床医学，2016，36（6）：58-59.

[10]王賽，周国华.氨基水杨酸类联合微生态制剂对溃疡性结肠炎的维持治疗进展[J].实用药物与临床，2015，12（4）：463-466.

[11]伍静，苏春萍，王显超，等.乳酸菌和双歧杆菌制剂对小鼠肠道菌群失调模型的调节作用[J].科学技术与工程，2013，13（16）：4497-4500.

[12]张婧，程中.肠道微生态制剂及其临床应用和研究进展[J].中国普外基础与临床杂志，2008，15（6）：463-466.

[13]钱家鸣，梁子键.微生态制剂在炎症性肠病中的应用[J].国实用内科杂志2016，36（9）：733-735.

[14] Moayyedi P，Surette M G，Kim P T，et al.Fecal Microbiota Transplantation Induces Remission in Patients With Active Ulcerative Colitis in a Randomized Controlled Trial [J].Gastroenterology，2015，149（1）：102-109.

[15] Rossen N G，Fuentes S，van der Spek M J，et al.Findings From a Randomized Controlled Trial of Fecal Transplantation for Patients With Ulcerative Colitis [J].Gastroenterology，2015，149（1）：110-118.

[16] Colman R J，Rubin D T.Fecal microbiota transplantation as therapy for inflammatorybowel disease：a systematic review and meta-analysis[J].Journal of Crohn’s & Colitis，2014，8（12）：1569-1581.

[17]李琨，张彩风，夏永华，等.微生态制剂对溃疡性结肠炎的治疗效果及作用机制研究[J].中华胃肠外科杂志，2013，16（4）：336-339.

[18]王慧，张海娟，李志东.忍冬藤提取物对兔离体肠平滑肌的舒张作用及其机制[J].中国农业科学，2017，50（2）：372-379.

[19]卡力比夏提·艾木拉江，周玉东，闫书平.温度变化对家兔离体小肠平滑肌运动的影响[J].中国畜牧兽医，2016，43（8）：2060-2065.

[20]闰一帆，姜敏，孙明军，等.炎症性肠病与肠道菌群[J].国际消化病杂志，2015，35（2）：84-87.

（收稿日期：2017-05-18） （本文编辑：康玥）