酸性矿排水中微生物遗传多态性研究

氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans,T.f)是一种革兰氏阴性菌,具有化能自养、好气、嗜酸、适于中温环境等特性,广泛存在于酸性矿山水及含铁或硫的酸性环境中。

1氧化亚铁硫杆菌的生理特性

氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans):是生物湿法冶金过程主要的浸矿菌种。这种菌系短杆菌,很小,0.3～0.5×1.0-2.0um,圆钝末端,以单个、双个或几个成短链状存在。是一种化能自养菌,专性好氧,嗜酸性,广泛生活在金属硫化矿和煤矿的酸性矿坑水中。最适生长温度25℃～30℃。生长在pH1.4～6.0之间,最适pH2.0～2.5。T.f以氧化亚铁、元素硫以及还原态的硫化合物等来获得生命过程所需的能量,以空气中的二氧化碳为碳源,以氨或铵盐为氮源。有鞭毛,能快速游动,革兰氏染色阴性。在9K固体培养基上呈红棕色菌落,近杆形[5]。

2氧化亚铁硫杆菌的氧化机理

自20世纪60年代以来,因为它们具有特殊的生物学功能,吸引了许多学者对T.f和T.t的生理特性进行了研究。许多研究表明,T.t利用单质硫的能力比T.f强,但T.t不能利用硫酸亚铁。Wong和Hey对氧化硫酸亚铁的机理进行了详细的研究,指出能将亚铁氧化成三价铁,三价铁会与硫酸根离子发生反应产生铁矾沉淀,同时产生硫酸而引起pH的下降:

4FeSO4+02+2H2SO4→2Fe2(SO4)3+2H2O

(1)

6Fe3++4SO42-+12H2O→2HFe3(SO4)2(OH)6 +10H+(2)

Templellvl和Leathen等人研究发现氧化亚铁硫杆菌能将矿物中的硫化矿物氧化为硫酸和硫酸盐。Bryne等对T.f氧化硫化矿物的机制进行了详细的研究。并提出了一些常见矿物的主要反应机理,如黄铁矿和黄铜矿:

2FeS2+702+2H20→2FeSO4+2H2SO4

(3)

4FeSO4+02+2H2SO4→2Fe2(SO4)3+2H20

(4)

CuFeS2+402→CuS04+FeSO4 (5)

2Cu2S+02+2H2 SO4→2CuS+2CuSO4+2H20

(6)

CuS+202→CuS04(7)

3微生物分子生态学研究的一般方法和原理

微生物分子生态学是分子生态学的重要组成部分,是分子生物学、微生物生态学、微生物生理学与遗传学相互结合而产生的一门边缘学科。从目前的发展状况来看,当前的主要研究领域有:采用分子生物学技术研究不同自然环境中微生物的种类组成和群落结构以及它们的数量动态；环境因子对微生物基因表达的影响:自然条件下微生物之间遗传物质的转移:微生物与高等生物相互作用的分子机制,包括共生关系的建立、病原微生物的致病机制等。因此,微生物分子生态学是利用现代分子生物学的基础理论与技术,在分子水平上,研究微生物与其生态环境间相互关系的一门新兴学科。

3.1 一般研究方法

(1)平板涂布分离。

(2)显微镜观察:普通光镜、相差显微镜、透射电镜、扫描电镜。

(3)MPN法,即最大或然值计数法,是平板涂布分离法的一种,但由于广泛应用,被单独作为微生物研究的一种技术。

(4)活菌计数法,常见的用哑咙橙染色,活菌死菌颜色不一样。

3.2 分子研究方法

(1)纯种分离,G+C测定、16SrDNA, ISR测序、比对。

(2)变性梯度凝胶电泳(DGGE),通用引物PCR扩增同样长度的基因,常为16S的一段(300bp～400bp),割胶纯化、克隆测序,比对变性梯度凝胶电泳((DGGE)技术以土壤微生物群体的基因组DNA为研究对象,通过比较不同土壤中各种微生物的16SrRNA基因信息来了解微生物的多样性。

(3)FISH荧光原位杂交,设计不同荧光染料标记的特异探针,检测不同分类界元水平的细菌,可在细胞水平或者核酸水平与目标菌种杂交,在表面荧光显微镜或者CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)下监测。

(4)TRFLP,末端限制性长度多态性。

(5)ARDREA.RISA。

(6)流式细胞仪计数。

(7)Real-time实时荧光定量PCR监测技术。

(8)克隆转化法:通用引物扩增从水样、土样中提取得总DNA,获得全长的16S rDNA序列,随机克隆入载体,转化到大肠杆菌,挑取阳性菌落,用不同的限制酶酶切检测不同的克隆,测序、比对。

(9)DNA芯片技术,主要用来研究微生物的功能基因组学。

4本论文的立论依据

AMD的pH通常很低,严重的地方可达pH2.0,富含SO42-离子和Fe3+离子,易浸出废矿石中的有毒元素,如铅、砷、铬、铜等以及氰化物,对矿业生产、生态环境造成严重危害,所以就AMD的研究越来越重要。我国自1959年以来,对微生物处理污水的技术的研究已取得了一定的成果,但重点放在污水菌种的保藏的研究方面,而且就整体情况而言与国外相比要差的远,在污水处理微生物生物学方面的研究相对于前者明显滞后。不仅设备、工艺落后,更主要的是对微生物本身没有作进一步的研究,缺乏对菌种生物学性状较为全面的认识,譬如菌种的生理、生化性状以及分类地位的了解,缺乏对菌种分子水平上的认识及其在污水处理过程中菌种所参与的机理等的研究,因而也就不能很好的指导生产实践。从目前发表的一些较为零碎的文献及几本专著看出,在酸性污水中细菌的研究方面,生物领域的科技工作非常薄弱,主要是一些污水治理方面的专业人员在从事相关研究。

目前,我国对浸矿细菌的资源开发工作做的远远不够,根据国内外文献报道,用于处理酸性污水的细菌有氧化硫硫杆菌(A.Thiooxidans)和氧化亚铁硫杆菌((Acidithiobacillus ferrooxidans);钩端螺菌(Leptospirillum)、中等嗜高温菌,如文献报道的硫化杆菌属(Sulfobacillus),如热氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosuidooxidan)以及一些未确定分类位置的细菌、嗜酸嗜高温古细菌等。就细菌遗传多样性、系统学研究工作来说,目前国内发表的文献主要集中在放线菌、根瘤菌、嗜盐碱的古菌方面,对硫杆菌其他浸矿细菌的多样性及系统发育工作而言,国内尚见较为系统的报道。因此,对硫杆菌及其它浸矿细菌的多样性研究就很有必要。

(1)硫杆菌(Thiobacillus)及其它嗜酸菌分子系统学研究目标及意义。

在地球表面广泛分布有元素硫及其金属化合物而形成的许多特殊环境,如硫铁矿、地表及海底的含硫热泉等。近年来,由于各国微生物学家对极端环境条件中的微生物资源的研究开发成为一个热点,使得硫铁矿、含硫热泉等酸性条件中的微生物多样性的研究取得了较快的进展,发现了许多生理生化性状特殊的细菌,其中有些归属于硫杆菌,有些目前还未确定其系统位置。分子生物学技术在含硫的酸性环境微生物系统学、生态学研究中的广泛应用,不仅发现了许多常规技术不能发现的新细菌,也对这些细菌的分类及系统学地位的确定提供了有力的手段,同时对一些已知细菌的分类及系统位置进行了修订,使得传统意义上的硫杆菌分类更趋合理,尽量可以建立一个亚利士多德所谓的接近于自然的分类体系。对氧化亚铁硫杆菌系统学地位的确定不仅具有重要的理论意义,对指导细菌浸矿等生产实践中优良菌株的选择也具有直接的应用价值。我国地域广阔,各种含硫的矿产资源及自然生态环境非常多样化,蕴含着非常丰富的代谢硫的细菌资源,而倍受国外微生物学家的关注,因此加大这些细菌资源的开发和研究力度,将为这些细菌的生产应用实践奠定理论基础。本课题研究的目标之一就是大量开发我国不同酸矿环境中的微生物资源,尤其是一些硫氧化细菌及其这些细菌的分子系统学的研究。

(2)不同环境中嗜酸菌的遗传多样性研究及其意义。

由于Acidithiobacillusferrooxidans,A.thiooxidans,A.caldus, Leptospirillumferroo xidans这几种细菌能够氧化亚铁、还原性的金属硫化矿,目前被广泛应用于微生物湿法冶金、煤和天然气脱硫、酸性矿区的生态恢复治理、污水处理等技术,使得这些细菌成为微生物学家研究的热点之一。但是由于硫矿的化学组成不同与含硫酸性环境在地球上的生态分布与多样性极其复杂,使得这类细菌同一种不同菌株的生理生化性状表现出显著的不同,形成了表型差异明显不同的菌株,同时造成这些细菌不同菌株的遗传组成差异显著,即所谓的遗传多样性,利用分子生物学技术研究这些细菌的遗传差异,不仅有助于筛选、鉴定出性状明显不同、在浸矿实践中针对不同化学组成的矿体表现高效的菌株,反过来也可以从物种进化上阐明不同环境造成的选择压对细菌进化的作用以及细菌对环境的适应性,进一步对表型差异悬殊、介于相似种之间的菌株的系统学地位重新进行研究修订,并且有助于阐明自然界广泛分布的许多代谢硫、铁有关的细菌的起源及进化关系。目前,虽然微生物冶金基础研究被列为国家973重点基础发展计划,但我国在浸矿细菌的生物学基础研究方面所作的工作几为空白,对这些细菌的多样性有待进一步研究挖掘。从世界各地大量采集分离纯化菌株,进一步阐明这些细菌的分子系统学及进化关系,从遗传多样性的角度选择优良菌株,为应用于生产实践提供理论基础。

由于我国生态环境多样性非常丰富,存在各种各样的富含金属及硫化合物的生态环境,因此有可能分离到生理及遗传差异明显的不同菌种,存在非常丰富的种以上水平和种下水平的多样性。但到目前为止,国内对嗜酸细菌物种多样性和遗传多样性的研究几乎为空白,基于此这两个细菌多样性的研究是本课题的主要目标之一。

5前景展望

在研究的基础上,进行微生物优势群落的生理生化分析和限制多态性分析,可继续进行矿区酸性污水微生物类群多样性的研究,进而研究矿区酸性污水微生物类群的结构和分布的特异性,进而确定这些菌株分类学和系统发育学地位。由于条件有限,本研究许多方法、步骤还有待改进和完善(比如在提取污泥中细菌的方法上我们有待改进),在未分离和测序的种群中,还蕴藏着丰富的微生物资源,需要进行进一步的研究。随着工业污水微生物资源研究理论的发展和研究技术的完善,人们必定从工业污水微生物中获得瞩目成果,更好地为人们的生产生活服务。

参考文献

[1]布坎南R E,吉本斯 N E(中国科学院微生物研究所译).伯杰细菌鉴定手册(第8版)[M].北京:北京科学出版社,1981:636～637.

[2]Zheng SM (郑士民),Yan WM (颜望明).Autotrophic Bacterium.Beijing (北京):Beijing Science Press(北京科学出版社),1983:56～60.

[3]林建群,颜望明,林建强,等.硫杆菌的分子遗传学研究[J].微生物学杂志,2000,3,20(1).

[4]李龙海,缪应祺.酸性矿山水生化处理及资源化的探索[J].江苏理工大学学报,1998,19(2):69～73.

[5]张在海,王淀佐,胡岳华.氧化亚铁硫杆菌遗传选育方法探讨[J].湿法冶金,1999,4:28～31.