插上“基因组测序”的翅膀，病原微生物检测应用新进展

摘要：基因测序技术发展迅速，二代测序已代替一代测序被广泛应用，三代测序也已进入市场。测序技术目前逐渐被应用于病原微生物的检测，主要分为单一微生物de novo测序、单一微生物基因组重测序、复杂病原样品的宏基因组测序，检测结果快速精准。

关键词：病原微生物；基因组测序；宏基因组

1977年，英国的Sanger利用DNA复制的生物学特性，设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法，即经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法（Dideoxy chain termination），揭开了DNA测序技术新篇章。尤其是高通量测序[1]的发展，使得短短10年，一个人类基因组的测序由10年前的30亿美金发展到今天只要6000美金。测序技术快速发展推进了基因组测序应用于临床病原微生物的检测。2016年是我国精准医疗元年，也是基因组测序应用于临床诊断飞速发展的一年。国家卫计委发布《关于印发遏制细菌耐药国家行动计划（2016-2020）的通知》中支持耐药菌感染快速诊断技术的研发，特别是快速鉴别细菌与非细菌感染的技术设备、耐药菌快速检测。

测序技术的发展

（一）一代测序

1977年，Sanger等提出了的双脱氧核苷酸末端终止测序法，即在4个DNA合成体系中加入不同的放射性标记的ddNTP，通过电泳条带放射性自显影，根据条带的位置测DNA分子的序列，随后Gilbert等提出了化学降解法。Sanger 和Gilbert测序方法的提出标志着第一代测序技术的诞生。[1]

（二）二代测序（NGS）——高通量测序（HTS）

1990年，以荧光标记代替放射性同位素标记和毛细管电泳技术的发展大幅提高测序的通量。同时，研究者们又提出了焦磷酸测序法、连接酶测序法、杂交测序法等多种DNA序列测定方法。其中在焦磷酸测序法和连接酶测序法的基础上分别发展出了Roche公司454测序方法，和ABI公司的SOLiD测序方法。454、SOLiD 与Illumina公司的Solexa技术，在2005-2007年短短三年时间内相继推出，共同组成了第二代测序技术[1]。第二代测序技术的共同特点是极高的测序通量，使得测序周期和成本大幅降低，是目前微生物基因组测序的主流方法。

（三）三代测序

近两年，以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术[2]。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。SMRT技術的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%，但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。纳米孔单分子测序读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb，错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端。数据可实时读取，通量很高（30x人类基因组有望在一天内完成），起始DNA在测序过程中不被破坏而且样品制备简单又便宜。理论上它也能直接测序RNA，并且能直接读取甲基化的胞嘧啶。第三代测序有望解决目前测序平台的不足。

测序技术应用于病原微生物检测的类型

（一）单一微生物de novo测序

de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径[3]。目前主要利用二代测序技术进行de novo测序，临床上常见病原微生物的标准菌株多数已完成测序。

（二）单一微生物基因组重测序（Genome Re-sequencing）

全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略对重要的病原微生物进行高通量测序。

（三）单一微生物测序应用概况

临床上培养阳性的菌株可进行全基因组，24小时内可以完成鉴定，分型，耐药基因和毒力基因的分析，速度快而成本低。H7N9流感病毒最初分离时就是采用全基因组测序进行鉴定的。目前大部分典型可培养病原微生物均已完成测序，精准程度是质谱技术无法相提并论的。

（四）复杂病原样品的宏基因组测序（Magenomics）[3]

宏基因组测序研究的对象是整个微生物群落。相对于传统单个细菌研究来说，它的优势明显。主要有以下两点：（1）微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它们的很多特性是基于整个群落环境及个体间的相互影响的，因此做宏基因组测序研究比做单个个体的研究更能发现其特性；（2） 宏基因组测序研究无需分离单个细菌，可以研究那些不能被实验室分离培养的微生物。

（五）病原微生物宏基因组应用实例

2010年，华大基因研究院和欧洲科学家研究发现人体微生物组分布在肠道菌群呼吸道，皮肤表面，占人总体重中的1-3%，基因种类为人体的十倍，被称为人类第二基因组。从此开启了微生物宏基因组测序的研究。

病原微生物的测序检测展望

随着测序技术成本的降低，病原微生物测序检测将加速应用速度。非培养标本可直接检测宏基因组，已培养菌株可进行全基因组测序进行分型，耐药基因、毒力因子分析。病原微生物的测序技术将实现快速检测（24小时内），全面覆盖（目前是2700多种），达到精准医疗。

参考文献：

[1] 解增言等.DNA测序技术的发展历史与最新进展[J].生物技术通报，2010.8.

[2] 曹晨霞等.第三代测序技术在微生物研究中的应用[J]. 微生物学通报，2016.10.

[3] 秦楠等.高通量测序技术及其在微生物学研究中的应用[J]. 微生物学报，2011.4.