一株拮抗放线菌菌株的筛选与鉴定

摘要：采用平板对峙法与灰色关联度分析法从小麦和苹果根际土壤中筛选出对小麦纹枯病（Rhizoctonia cerealis）和小麦根腐病（Bipolaris sorokiniana）具有良好拮抗作用的放线菌，并依据菌落形态和培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析等进行鉴定。结果表明，菌株FX-H-51抑菌效果显著，对不利生长环境有良好的耐受性。形态学与分子鉴定结果表明，菌株FX-H-51为海棠链霉菌（Streptomyces spectabilis）。

关键词：放线菌；灰色关联度分析；拮抗活性；海棠链霉菌

中图分类号：S154.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）04-0043-05

Abstract Actinomycetes with strong antagonistic activity against Rhizoctonia cerealis and Bipolaris sorokiniana were screened out from wheat and apple rhizosphere soil by plate confrontation method and grey correlation degree analysis. They were identified according to the colony morphology and culture characteristics， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence. The results showed that the FX-H-51 strain had significant antibacterial effect and better tolerance to the unfavorable growth environment. The morphological and molecular identification results indicated that the FX-H-51 strain was to Streptomyces spectabilis.

Keywords Actinomyces； Grey relational degree analysis； Antagonistic activity； Streptomyces spectabilis

放线菌是陆生性较强的原核生物，同时也是一类具有重要经济价值和生物研究价值的微生物资源，其中链霉菌属（Steptomyces）的放线菌在植物病害生物防治中已有较多的研究报道。Coombs等[1]筛选出对小麦全蚀病有显著防治效果的链霉菌菌株；陈杰等[2]从26株供试拮抗放线菌中筛选出对马铃薯土传病原真菌有较强拮抗效果的链霉菌菌株。链霉菌在自然环境中多见于土壤和海洋水体，其种类丰富多样，产生的抗生素及其它次生代谢物质在植物病害生物防治方面具有重要作用[3，4]。在已经发现的抗生素中，近60%是由放线菌产生，其中链霉菌属占90%左右[5]。

近年来，小麦土传病害如纹枯病、根腐病[6，7]等在黄淮海麦区的发生逐年加重，给农业生产带来了严重损失，目前生产上还没有非常有效的防治方法。利用拮抗微生物防治该类土传病害具有良好的应用前景。

本研究在前期从土壤中分离得到大量放线菌的基础上，从中筛选获得一株对小麦纹枯病菌、根腐病菌表现出较强抑制活性的菌株FX-H-51，并对该菌株进行了鉴定，以期为小麦根茎部病害的绿色防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株：实验室保存的放线菌菌株116株，分离自陕西、山西、甘肃等地的苹果园果树根际重茬土以及山东各地小麦田根际土。用于进行拮抗筛选的病菌：禾谷丝核菌（WK207，Rhizoctonia cerealis）、平脐蠕孢菌（WB112，Bipolaris sorokiniana）、黄色镰孢菌（WF25，Fusarium culmorum），所用供试病原真菌均由山东农业大学真菌与真菌资源利用实验室提供。

培养基：菌株筛选、培养用高氏1号培养基，真菌培养及抗菌作用分析用PDA培养基；麦芽糖发酵培养基 。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗放线菌菌株的初筛 采用平板对峙法[8]测定放线菌菌株对3种病原真菌的拮抗作用。25℃培养7 d，每个处理重复3次。观察各菌株对靶标菌的抑制效果，选取有明显抑制圈的菌株作为复筛菌株。

1.2.2 拮抗放线菌菌株的抑菌防治效果试验 将初筛得到的菌株各自及组合的发酵液进行温室盆栽试验。取3种病原真菌分别接种在麦粒培养基中，25℃培养7 d，进行扩大繁殖，作为接种体。小麦种子均匀播于盆中，每盆10粒，每粒附近接入1粒接种体，然后用土壤覆盖。取5 mL发酵液分別均匀加入盆中，以不加发酵液为对照，每个处理重复3次，30 d后统计发病情况。

1.2.3 拮抗放线菌菌株的复筛 利用灰色关联度分析法对初筛得到的菌株的生防效果及耐性进行综合评判[9-11]。生防效果以初筛时平板对峙试验结果作为判定依据。耐性评价主要是菌株对温度、酸碱性、抗生素的耐受能力，各性状的评价指标为：耐低温性是10℃条件下培养6 d后的菌落直径，耐高温性是40℃条件下培养6 d后的菌落直径；耐酸性是pH=3、25℃条件下培养6 d后的菌落直径；耐碱性是pH=11、25℃条件下培养6 d后的菌落直径；对链霉素的耐性是菌株在含1 mg/L链霉素的高氏1号培养基上培养6 d后的菌落直径。

根据灰色系统理论，将所有供试菌株视为一个灰色系统，每一菌株都是系统中的单一灰因素，选取供试菌株各项性状最优值作为“参考菌株”各项性状指标，构成的数列即参考数列X0。而比较数列Xi（i=1，2，3，4）是供试菌株各项性状指标构成的数列，将X0与Xi进行数据量化处理，求出各供试菌株与参考菌株的关联度，并按关联度大小排出关联序。

1.2.4 菌株鉴定 形态特征观察及生理生化特征测定参照《链霉菌鉴定手册》[12]和《微生物学实验手册》[13]的相关内容；分子生物学鉴定参照徐平等（2003）[14]和姜淑梅等（2007）[15]的相关内容。以27F和ITS4为引物对菌株的16S rDNA进行PCR扩增，对目的基因进行克隆测序，得到菌株的16S rDNA序列。在NCBI数据库中进行BLAST相似性分析，查询与菌株相近的16S rDNA序列，利用MEGA4.1软件构建系统发育树。

1.3 数据分析

利用DPS软件对X0与Xi进行数据量化处理，得到4株放线菌菌株与参考菌株的关联度。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌菌株的初筛

根据抑菌半径的大小，初步筛选到对3种病原菌抑菌效果均较好的4个菌株，见表1。

2.2 拮抗放线菌菌株对小麦纹枯病、根腐病的防治效果

图1表明，菌株FX-H-51对禾谷丝核菌引起的小麦纹枯病的防治效果最好，达到81.20%；菌株FX-S-178对黄色镰孢菌引起的小麦根腐病防治效果最好，达到76.53%。单个菌株仍是菌株FX-H-51对平脐蠕孢菌引起的小麦根腐病防治效果最好。两两组合的菌株处理表现都不理想。菌株FX-H-51、FX-H-71、FX-S-178组合对平脐蠕孢菌引起的小麦根腐病防治效果最好，达到75.10%。三个菌株组合的处理提高了对蠕孢菌的控制效果，但没有提高其对黄色镰孢菌和禾谷丝核菌的控制效果。

2.3 拮抗放线菌菌株的综合评价

以4株放线菌菌株对峙WK207的抑菌半径及耐性测定结果为指标构建参考菌株（表2）。

表3表明，菌株FX-H-51的综合性状与参考菌株的灰色关联度值最高，是比较理想的抗病抗逆放线菌菌株。

2.4 菌株FX-H-51的形态学及生理生化鉴定

菌株FX-H-51在高氏1号培养基上菌落生长繁茂，边缘不规则向四周扩散，呈橙红色，表面绒状隆起且干燥不透明。气丝直杆状，浅粉色，基丝橙红色，无横隔，孢子椭圆形，表面光滑（图2）。菌株FX-H-51能使明胶全部液化，牛奶凝固且胨化，能够水解淀粉跟纤维素，但水解纤维素能力较弱，硝酸盐不还原，不产生硫化氢（图3）。

2.5 菌株FX-H-51的分子生物学鉴定

对菌株FX-H-51的16S rDNA进行PCR扩增，获得一条1 447 bp的条带（图4），之后克隆测序得到菌株FX-H-51的16S rDNA序列，通过比对分析并构建系统发育树（图5）可以看出，菌株FX-H-51与海棠链霉菌（Streptomyces spectabilis，基因登录号为KC737552.1）的16S rDNA序列同源性最高，并且在系统发育树中聚于同一分支中。

根据以上形态特征和生理生化特性，FX-H-51符合链霉菌属的相关特征；进一步由16S rDNA序列测定结果，最终确定该菌株为海棠链霉菌（Streptomyces spectabilis） 。

3 讨论与结论

灰色关联度分析法是对目标性状进行综合描述和量化评估的一种有效方法，能够全面、客观地评价每个菌株的表现，克服了方差分析或回归分析等方法中仅考虑抑制率一个因素而使某些综合性状较好的菌株被埋没的弊端。本研究利用灰色关联度分析法，对4株抑菌效果较好的放线菌菌株进行了综合评价，这将为筛选高效生防菌株提供借鉴。

小麦土传病害是严重影响小麦产量的根部病害，化学防治是目前农业生产上最主要的防治方法。放线菌资源丰富，近年来在农业生产中已有越来越多的应用，尤其是链霉菌在生物防治方面也有大量发现和报道。魏晓丽等[16]从青藏高原分离得到的4株放线菌均能明显提高棉花幼苗整株和根系鲜重。Evangelista-Martinez等[17]从土壤中分离了一株放线菌，其对黑曲霉、长蠕孢菌等的抑菌率为47%～90%。申屠旭萍等[18]对淀粉酶产色链霉菌进行研究表明，其代谢产物丰加霉素对黄瓜枯萎病、菜豆炭疽病、番茄灰霉病等致病菌有很好的拮抗作用。目前利用链霉菌防治小麦土传病害的报道相对较少。本研究从116株放线菌中筛选出一株具有较好耐受性的高效生防放线菌FX-H-51，根据形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列测定结果，确定该菌株为海棠链霉菌（Streptomyces spectabilis） 。放线菌菌株FX-H-51对小麦纹枯病及根腐病的生防效果较好，具有良好的开发潜力，为进一步应用到农业生产奠定了基础。

参 考 文 献：

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