牛肉中金黄色葡萄球菌的复核鉴定研究

材料与方法

1.1样品

选取送检的鲜牛肉样品进行试验。

1.2标准菌株与试剂

金黄色葡萄球菌阳性菌株，由伊犁出入境检验检疫局实验室保存。7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker琼脂平板、脑心浸出液肉汤（BHI）、兔血浆、革兰氏染色液，均购自北京陆桥技术股份有限公司；金黄色葡萄球菌鉴定引物和探针、chelex 100粉末、PCR试剂等，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3仪器

恒温培养箱（宾得400型）、实时荧光定量PCR仪（ABI 7500型）、天平（梅特勒MS1602S型）、均质器（AES EasyMix型）、离心机（贝克曼Allegra X-22R型）。

1.4样品的处理

无菌操作取样，制成匀质检样，称取25 g匀质检样至盛有225 mL 7.5%氯化钠肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2 min，制成1∶10的样品匀液，用于金黄色葡萄球菌的检测。

1.5增菌

将上述样品匀液于（36±1）℃下培养18～24 h。

1.6分离培养

将上述培养物分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板（36±1）℃下培养18～24 h，Baird-Parker平板（36±1）℃下培养45～48 h，培养结束后观察菌落生长特征。

挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个及以上，接种到5 mL BHI，（36±1）℃下培养18～24 h。同时，进行革兰氏染色并镜检。

1.7血浆凝固酶试验

取新鲜配制兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2～0.3 mL，振荡摇匀，置于（36±1）℃温箱内，每30 min观察1次，观察6 h。同时，以金黄色葡萄球菌标准阳性菌株肉汤、阴性葡萄球菌菌株的肉汤和BHI肉汤空白培养基为对照。

1.8实时荧光定量PCR检测

1.8.1模板DNA的制备。

1.8.1.1增菌液模板DNA的制备。

分别取“1.5”和“1.6”中培养的7.5%氯化钠肉汤增菌液和BHI培养物各1 mL，分别加入1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心5 min，弃上清；每管加入50 μL DNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清保存于-20 ℃下备用。

1.8.1.2可疑菌落模板DNA的制备。

挑取“1.6”中Baird-Parker平板和血平板上的可疑菌落，分别加入50 μL DNA提取液，混匀后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清保存于-20 ℃，备用。

1.9实时荧光定量PCR检测

1.9.1实时荧光定量PCR反应体系。

实时荧光定量PCR反应体系（25 μL）：10×PCR缓冲液2.5 μL、引物对（10 μmol/L）各1 μL、探针（10 μmol/L）1 μL、dNTP（10 mmol/L）1 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL、水16 μL、模板DNA 2 μL。

1.9.2实时荧光定量PCR反应条件。

37 ℃ 5 min，95 ℃预变性3 min，94 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸40 s，同时收集FAM荧光，进行40个循环；4 ℃下保存。

1.9.3检测质控。

检测过程中分别设置阳性对照（阳性菌株DNA）和空白对照（无菌水）。

2结果与分析

2.17.5%氯化钠肉汤增菌

样品匀液在7.5%氯化钠肉汤中于36.5 ℃条件下培养24 h，呈现混浊生长。

2.2分离菌在Baird-Parker和血平板上的培养特性

在Baird-Parker平板上，菌落直径为2～3 mm，颜色呈灰色至黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有1个透明圈。用接种针接触菌落时，有似奶油至树胶样的硬度。

在血平板上，菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、白色，菌落周围可见完全透明溶血圈。

2.3分离菌的革兰氏染色特征

革兰氏阳性球菌，呈紫色，圆形，呈单个短链和葡萄串状排列，无芽孢、无荚膜，直径约为0.5～1.0 μm。

2.4血浆凝固酶试验

标准阳性菌株和待检分离菌均使血浆凝固，将试管倾斜或倒置时呈现凝块，而阴性对照菌株和BHI肉汤空白培养基均无凝固现象，因此判定分离菌株的血浆凝固酶试验为阳性。

2.5实时荧光定量PCR检测

分别对分离培养检样的75%氯化钠肉汤增菌液、BHI肉汤培养物、Baird-Parker平板和血平板上的可疑菌落进行了实时荧光定量PCR检测，阴性和阳性对照成立，样品Ct值≤35.0，判定样品检测结果均为阳性（图1）。

3结论与讨论

笔者采用国家标准方法中选择性培养基细菌培养和分

离、显微镜下形态学鉴定、溶血现象、血浆凝固酶试验等开展牛肉中金黄色葡萄球菌的检测，分离鉴定出牛肉中金黄色葡萄球菌可疑菌落，并运用实时荧光定量PCR方法进行了结果复核，检测结果相一致，确保了检测的准确性。陈丽丽等[10]建立了金黄色葡萄球菌分离鉴定的质量控制方法，采用血浆凝固酶试验、生化鉴定、实时荧光定量PCR等方法进行质控确证，验证了3种试验方法检测结果的相关性，试验表明菌株鉴定时可采取多种检测方法，以提高检测结果的准确性。

为确保检测结果的准确性，在实际检测工作中分离并鉴定金黄色葡萄球菌可疑样品时，可采用不同的试验方法进行验证和复核，该研究结果对畜禽肉中致病菌的准确检测具有参考价值和指导意义。

参考文献

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