异养硝化—好氧反硝化菌Bacillus,sp.JB4的分离鉴定试验

材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品

试验样品采自福州市闽侯县某排污口淤泥、闽江口某池塘废水及淤泥、建瓯福矛酒厂酒曲和堆积样等。

2.1.2 培养基

（1）BTB培养基[5，6]（g/L）：丁二酸钠 4.72，NaNO3 0.85，KH2PO4 1.00；FeSO4·7H2O 0.20；MgSO4·7H2O 0.10，溴百里酚蓝1 mL，琼脂15（固体培养基加入），pH值=7.0～7.3。

（2）异养硝化培养基（HNM）（g/L）：（NH4）2SO4 0.24，丁二酸钠2.17，维氏盐溶液50mL，琼脂20（固体培养基加入），pH值=7.0。

（3）维氏盐溶液（g/L）：K2HPO4·3H2O 6.50，MgSO4·7H2O 2.50，NaCl 2.50，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.04 。

（4）好氧反硝化培养基（DM）（g/L）：把异养硝化培养基中的氮源改成KNO3 0.72，其它同异养硝化培养基，pH值=7.0。

（5）LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 5，葡萄糖2，琼脂20（固体培养基加入），pH值=7.0～7.2。

2.2 异养硝化-好氧反硝化细菌的分离筛选

分离纯化菌株主要运用梯度稀释平板法和平板划线法[7]。将样品稀释液涂布于异养硝化固体培养基上培养，待长出单菌落，挑取不同形态菌落进行多次划线分离后得到纯菌株，将其接种到斜面培养基中保存并编号。结合格林斯试剂法[8]和BTB法[9]，对分离得到的菌株进行异养硝化活性和好氧反硝化活性的鉴别，初步判断筛选的菌株是否为异养硝化-好氧反硝化菌。将初筛得到的菌株接种于异养硝化液体培养基中进行培养，测定氨氮的含量并计算脱氮率，选取脱氮效果较好的菌株作为实验菌株进行后续研究。

2.3 菌株的鉴定

2.3.1 形态学鉴定

将待鉴定的菌株接种到LB培养基平板上，28 ℃培养48h后观察菌落特征；并挑取少量菌体制片进行革兰氏染色和芽孢染色，然后光镜观察菌体形态；同时，用JSM-6500F扫描电子显微镜观察菌体形态并摄像。

2.3.1 生理生化鉴定

菌株的生理生化特性采用细菌自动鉴定系统进行测定。

2.3.2 16SrDNA序列测定与系统发育分析

16SrDNA测序由铂尚生物技术（上海）有限公司完成。将所得序列信息提交GenBank数据库BLAST比对后，选择同源性较高的相关序列，由Clustal X序列比对软件进行多序列匹配，然后由Mega 4.0构建菌株JB4的16SrDNA系统进化树。

2.4 生长及脱氮曲线

将筛选得到的异养硝化-好氧反硝化菌株接种于LB液体培养基中前培养12 h（30 ℃，150 r/min），得到种子液。然后将种子液以5%的接种量分别接入装有100 mL初始氨氮浓度为65.45 mg/L的异养硝化培养基和初始硝态氮浓度为442 mg/L的好氧反硝化培养基中，于150r/min，30 ℃摇床培养，每隔4h取样测定OD600以及NO-3-N、NO-2-N、NH+4-N的浓度，计算脱氮率。并以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，绘制菌株的生长及脱氮曲线。

2.5 分析方法

硝态氮的测定采用麝香草酚分光光度法[10]；氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法；亚硝态氮的测定采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法[11]；菌体生长量测定采用浊度法（OD600）。

3 结果和分析

3.1 异养硝化-好氧反硝化菌株的分离与鉴定

经多次分离纯化，筛选得到一株具有较高脱氮能力的异养硝化-好氧反硝化菌株，命名为JB4。

3.1.1 形态学鉴定

菌株JB4在LB培养基平板上28 ℃培养48 h后呈现的菌落特征为：圆形，白色，表面褶皱，有光泽，边缘呈波状，不透明。菌落直径为0.3～0.8 cm。菌株JB4革兰氏染色阳性，细胞呈直杆状、有芽孢，菌体大小为（0.57～0.95） μm×（1.71～3.8） μm，如图1所示。

3.1.2 生理生化特性

菌株JB4的生理生化特性为：兼性厌氧；可以在含有海藻糖、蔗糖、D-甘露糖、D-甘露醇、葡萄糖、D-核糖培养基上生长并产酸，不能在含有D-棉子糖、D-麦芽糖、乳糖、D-山梨醇、D-木糖培养基上生长并产酸；精氨酸双水解酶1阳性，精氨酸双水解酶2阴性；L-乳酸盐产碱阳性；酪氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶阳性。该菌株能在盐度为6.5%的培养液中生长。

3.1.3 16SrDNA序列测定与系统发育分析

提取并测定片段长度为1417bp的16SrDNA序列。此序列在NCBI数据库中进行同源性比较，结果显示菌株JB4和多株Bacillus sp.16SrDNA的相似性达99%以上，结合菌株的形态特征和生理生化特性，初步鉴定其为Bacillus sp.。选取同源性较高的序列用Mega 4.0软件，以Neighbor-joining法绘制系统进化树。

3.2 JB4生长曲线及脱氮性能

菌株JB4在30 ℃、150 r/min条件下摇床培养，每隔4h测定OD600及NO-3-N、NO-2-N、NH-4-N的浓度，计算脱氮率，结果如图2所示。菌株JB4在初始氨氮浓度为65.45 mg/L的异养硝化培养基中的生长降解曲线如图2（A）所示。由OD600的变化可知，菌株JB4在0～4 h是适应环境的延迟期，合成各种酶。4～12 h为对数期，16 h时菌株的OD600达到最大值为0.671，16～24 h为衰亡期。由氮的质量浓度变化可知，菌株JB4的硝化反应基本上是在延迟期和对数期完成，培养8 h后，氨氮质量浓度由65.45 mg/L降到31.81 mg/L，脱氮率达到51.40%，12 h后降到最低14.54 mg/L，脱氮率高达77.78%。但是从16 h开始氨氮质量浓度有回升趋势，上升到17.16 mg/L，这可能是因为16h达到了菌株生长的对数末期，菌体开始发生自溶，释放氨氮，菌株死亡释放的氨氮比菌株硝化的氨氮多。在整个硝化过程中没有亚硝态氮的积累，但是有少量硝态氮的积累，培养4h后便产生了14.96 mg/L的硝态氮，培养12 h后降至8.59 mg/L，之后几乎不再变化。相比于已报道的相关菌株[4，6]（菌株X3经12 h培养，氨氮浓度从初始42降到18.17 mg/L，去除率为56.74%；菌株XF3经42h培养，可将73 mg/L氨氮几乎完全降解，但是亚硝态氮积累量达25.34 mg/L），菌株JB4具备氨氮去除速率高且不积累亚硝态氮的优势。该试验以氨氮为唯一氮源，并且在脱氮过程中只检测到氨氮和硝态氮，故认为培养基中总氮（TN）=总无机氮（TIN）=硝态氮+氨氮。由图2可知TIN的降解曲线与氨氮的降解曲线保持一致。这说明菌株JB4具备高效的硝化能力，且具有同步硝化反硝化的能力。

菌株JB4在初始硝态氮浓度为442 mg/L的好氧反硝化培养基中的生长曲线如图2（B）所示。由OD600变化可知，菌株JB4在0～4 h是延迟期， 4～12 h为对数期，16 h后OD600达到最大值0.642，20 h降至0.546，之后保持稳定，基本与在异养硝化培养基中的生长规律一致。由硝态氮的质量浓度变化可知，菌株JB4培养4h后的硝态氮由442 mg/L降至70.30 mg/L，脱氮率达到84.09%，12h后降到最低61.58 mg/L，脱氮率达到86.07%。反硝化过程的第一步是还原成亚硝态氮，然后再转变成N2O和N2。由刘俊女的研究[12]可知，亚硝态氮的累积与脱氮中间产物N2O的生成有正相关关系，而该实验中的亚硝态氮的累积量很小，最高也不超过1.83 mg/L，可以推测脱氮过程中N2是最主要的最终脱氮产物。与已报道的相关菌株X3和XF3相比[4，6]（菌株X3经12h培养，硝态氮浓度从初始42 mg/L降到29.80 mg/L，去除率为29.05%，培养18h时硝态氮降至12.32 mg/L，去除率为70.67%；菌株XF3经48 h培养，硝态氮浓度可从初始84 mg/L降到9 mg/L，脱氮率高达89.3%，但是亚硝态氮积累量达到11.22 mg/L），菌株JB4硝态氮去除速率更高。此结果说明菌株JB4具备高效的好氧反硝化能力，且反硝化作用主要发生在菌株生长的对数期。

4 结论

（1）从福矛酒厂的堆积样中分离到一株异养硝化-好氧反硝化细菌JB4。JB4生长迅速、脱氮效果高，亚硝态氮积累量低于1.83 mg/L。

（2）经形态观察、生理生化特性鉴定及16SrDNA序列分析，将JB4鉴定为芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp.）。

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