1个广谱抗真菌天然产物的快速鉴定及活性评价

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。放线菌HBERC-31270分离自湖北咸宁采集的山坡树林根际土，土样编号为S-1699，由湖北省生物农药工程研究中心分离保藏。农药活性测定用指示真菌包括番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，BOTCIN）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani，RHISOL）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum，FUSCUL）、小麥颖枯病菌（Septoria nodorum，SEPNOD）、番茄早疫病菌（Alternaria solani，ALTSOL）、蚕豆锈病菌（Uromyces fabae，UROFAB）。

1.1.2 培养基。斜面培养基：ISP-2培养基。采用18 mm×180 mm 玻璃试管，每管装琼脂培养基8～10 mL。种子培养基：同ISP-2，不加琼脂。采用500 mL带挡板三角瓶，每瓶装培养基100 mL，121 ℃灭菌30 min。发酵培养基：主要成分为葡萄糖、棉籽蛋白、酵母浸粉等。采用500 mL带挡板三角瓶，每瓶装培养基100 mL，121 ℃灭菌30 min。

1.1.3 主要仪器与数据库。Ly-0.8型冰冻干燥机，上海东富龙科技有限公司生产；

Waters高效制备液相色谱仪（Waters 2525泵，带2767自动收集系统，2996二极管阵列式检测器）；液相色譜-质谱联用仪，采用Waters 2695高效液相色谱仪（Waters 2996 二极管阵列式检测器）、Micromass Quattro micro质谱仪（电喷雾离子源ESI）以及Masslynx V4.1液质联用分析软件；查普曼天然产物数据库2003版。

1.2 方法

1.2.1 菌株摇瓶发酵。从斜面取8～10 mm的1块菌苔转移至种子摇瓶中，置于28 ℃、150 r/min旋转式摇床上振荡培养72～96 h，按10%（V/V）的接种量转接至发酵培养基中，置于28 ℃、150 r/min旋转式摇床上振荡培养100～120 h，即完成发酵。

1.2.2 发酵液冻干与提取。将发酵液转移至不锈钢冻干盒中，置于冻干机中冰冻干燥，冻干条件为：-40 ℃预冻2 h，将冷阱预冷至-45 ℃以下，然后开启真空泵升华。真空度为50～90 Pa，升温速率为2～3 ℃/h，极限温升为37 ℃。冻干完成后，转移至三角瓶中，先用少量50%甲醇-水湿润，再加入100 mL乙酸乙酯，于摇床上180 r/min振荡萃取1 h，分离出乙酸乙酯相，旋转蒸发，除去溶剂，以少量甲醇溶解，12 000 r/min离心3 min，取上清液送HPLC-MS分析。

1.2.3 提取物生物活性测定。取一定量发酵提取物，加入乙醇溶解，以纯水稀释至一定浓度后，用96孔板进行生物活性测试。组分活性测试采用相同的靶标及方法。

1.2.4 提取物液质联用分析。色谱柱为美国Sunfire C18柱，150.0 mm×2.1 mm（i.d），粒径为3.5 μm，柱温为40 ℃，进样量为2 μL，流动相为超纯水和色谱纯乙腈，梯度洗脱。质谱检测条件：电喷雾电离（ESI），毛细管电压为3.5 kV，锥孔电压为70 V，离子源温度为100 ℃，干燥气温度为300 ℃，脱溶剂气体流速为500 L/h，锥孔气体流速为50 L/h。

1.2.5 提取物鉴定。根据组分活性测定结果，确定活性成分的保留时间，从高效液相色谱（HPLC）中精确提取活性物质的紫外吸收光谱，确定吸收峰的波长。从正、负离子流图谱中可判定目标产物的分子离子峰。将吸收峰波长及分子量输入Chapman天然产物数据库，查询同该物质性质相同或相近的化合物名称及其结构式，通过理化及生物学性质，确定活性化合物的种类及结构式。

1.2.6 发酵液室内活性评价。采用对峙法。

抑菌率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径-菌饼直径）×100%

1.2.7 发酵液盆栽活性评价。

采用小麦、蚕豆、番茄幼苗，进行HBERC-31270发酵液的盆栽活性评价。供试幼苗均在室内培养14 d左右。将发酵液加入0.1%吐温-80后喷于幼苗叶面，24 h后接入病原菌孢子。以清水加0.1%吐温-80为空白对照，7 d后进行调查。

分级方法：0级，叶片无病斑；1级，病斑面积占叶片面积的5%以下；3级，病斑面积占叶片面积的6%～10%；5级，病斑面积占叶片面积的11%～20%；7级，病斑面积占叶片面积的21%～50%；9级，病斑面积占叶片面积的50%以上。

2 结果与分析

2.1 HBERC-31270发酵提取物的农药活性

从表1、2可知，具有抗真菌活性的组分出现在14～21 min，其余组分无活性。

2.2 HBERC-31270提取物的HPLC及紫外吸收光谱（UV）

由图1、2可知，保留时间为16.60 min的化合物紫外吸收峰为237、292 nm，该吸收光谱特征明显，最强吸收峰（237 nm）的吸光强度为1.0，比弱峰（292 nm，吸光强度为0.1）高出约10倍，该特征为紫外吸收光谱的重要特征（相当于摩尔吸光系数ε）。

2.3 HBERC-31270活性产物的质谱（MS） 由图3可知，在正离子流中m/z 616.4处有1个强峰，m/z 633.2处有1个次强峰，一般情况下，可能会将这2个峰之一作为分子离子峰。不过，由于MS的特征，常会出现2个分子结合在一起形成质谱峰，即产物的分子量约为该值的50%。在负离子流中，最高丰度为m/z 307.1，正离子流中对应峰为m/z 308.9。根据MS特征，判定该峰为产物分子离子峰，即该产物的分子量为308.00 Da。

2.4 活性化合物的快速鉴定 将化合物分子量及紫外吸收峰波长输入Chapman化合物数据库查询，条件为分子量在307～309，紫外吸收峰值波长23*和 29*（*号代表任意值，考虑到不同仪器间的误差）。查询得到3个化合物，1个来自放线菌，另外2个来自其他植物，据此初步判断活性产物为源于放线菌的9-甲基链米酮，其分子量为307.38 Da。

查询文献[11-12]可知，9-甲基链米酮的摩尔吸光系数ε（λ230 nm）为23 100，ε（λ291 nm）为790，与该菌株活性产物紫外光谱相似。

确定该化合物分子式为C17H25NO4，其结构式如图4所示。

2.5 HBERC-31270室内及田间活性评价 由图5、6可知，HBERC-31270不仅对常见农作物真菌病害如番茄灰霉病、水稻纹枯病等具有较好的抑制效果，对小麦白粉病、蚕豆锈病等也具有较好的防治效果。

3 讨论

进行天然产物结构的鉴定通常需要四大光谱，即红外光谱、紫外光谱、质谱和核磁共振谱。红外光谱提供了化合物

分子振动的信息，紫外光谱则是分子内部电子能级跃迁的

结果，质谱提供了分子离子及其碎片的信息，核磁共振譜则体现了化

合物中化学键的关系。红外及核磁共振谱的获得

需要有一定量的纯化合物（纯度95%以上，质量2 mg以上），并进行高分辨质谱、氢谱、碳谱分析及结构解析，这些化合物的获得需要进行发酵、提取、精制等程序，费时费力，所以采用四大光谱进行化合物的鉴定非常耗时。一般鉴定1个未知化合物需要1至数月甚至更长时间。

在微生物源天然产物的筛选过程中，由于筛选到的绝大多数活性化合物均已知，如对每一活性化合物进行四大光谱分析，则费时费力。因此，在筛选过程中，进行化合物的快速早期鉴别，对天然产物的研究开发具有重要意义。

据文献报道，9-甲基链米酮属亚胺类天然产物，具有广谱抗真菌活性，并有抗病毒活性，且毒性明显低于同类天然产物放线菌酮（环己酰亚胺）。同后者相比，国内极少见相关文献报道。由于其良好的抗真菌活性和较低的毒副作用，推测该产物具有良好的应用开发前景。

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