壳聚糖固定化乙醇脱氢酶的酶学性质研究

材料工业、农业、医药、食品、化妆品以及环保等诸多方面具有广泛的用途[2-4].

乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）大量存在于人类和动物肝脏、微生物细胞及植物组织内，是广泛专一性的含锌金属酶，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）为辅酶，催化生物体内伯醇的氧化和醛的还原.乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）共同构成乙醇脱氢酶系，参与体内乙醇代谢，是人和动物体内重要的代谢酶[5-6].

固定化酶（immobilized enzyme）是20世纪60年代发展起来的一种新技术，将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态，并在一定的空间范围内起催化作用，能反复和连续使用的酶[7-9].本文作者以壳聚糖作为载体，戊二醛作为交联剂，将乙醇脱氢酶固定化，与游离的乙醇脱氢酶作比较，进而研究壳聚糖固定化乙醇脱氢酶的酶学性质，为工业生产提供更多的理论依据.

1材料与方法

1.1材料

壳聚糖（自制，脱乙酰度大于80%）；乙醇脱氢酶为BBI公司（Canada）产品；戊二醛由上海试剂厂分装，浓度为25%（v/v）；其他试剂均为分析纯或者生化试剂.

1.2方法

1.2.1甲壳素及壳聚糖的提取[10]

称取200 g干虾壳置于4% 的HCl溶液中浸泡，期间不断搅拌使虾壳中钙质充分分解，用自来水充分洗净，直至pH呈中性后用10%（g/v） 的NaOH溶液浸没，并放置于温度设定为90 ℃的烤箱内7 h以上，取出过滤.重复脱钙、去蛋白便可得到甲壳素.将得到的甲壳素用40% 的NaOH浸没，放置于温度设定为100 ℃的烤箱内7 h以上，进行脱乙酰化反应后得到壳聚糖.

1.2.2壳聚糖固定化酶的制备[11-14]

称取3 g壳聚糖溶于1%的醋酸溶液中，缓慢搅拌过夜使其充分溶解并抽滤，滤液用2 mol/L NaOH调节pH至12，产生大量白色絮状沉淀后，抽滤，用蒸馏水洗至中性后悬浮于pH 7.8 Tris-HCl缓冲液中，再加入0.5 mL乙醇脱氢酶原酶液，搅拌吸附1 h，加入25%戊二醛，使其终浓度为0.6%（v/v），搅拌吸附6 h，抽滤水洗，制备获得壳聚糖固定化酶，于4 ℃冰箱中保存备用.

1.2.3蛋白酶浓度的测定[15-16]

采用Lowry法对乙醇脱氢酶溶液蛋白浓度进行测定，并在650 nm波长下测定吸光度变化值.

1.2.4酶活力的测定

称取0.5 g的固定化醇脱氢酶，加入6 mL、pH 7.5 NaHPO4/NaH2PO4缓冲溶液，37 ℃下水浴10 min，然后加入2 mol/L乙醇和4.5 mmol/L NAD+，37 ℃下水浴5 min，回收固定化酶，反应液立刻置于沸水中灭活1 min，并在320 nm波长下测定吸光度变化值.

2结果

2.1戊二醛浓度对固定化酶蛋白浓度以及酶活力的影响

戊二醛既是交联剂又是酶的变性剂，戊二醛的浓度对固定化酶的活性具有重大的影响，分别使用浓度为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和2.0%的戊二醛与殼聚糖载体交联，测定不同条件下固定化酶蛋白量和酶活力.

从图1、2可以看出在交联体系中，戊二醛终浓度为0.6%时，固定化酶的酶活性是最高的.浓度低于或者高于0.6%，酶活性都会下降.

2.2pH值对固定化乙醇脱氢酶稳定性的影响

在pH值 6.0～11.0 范围内，测定不同pH值条件下游离酶和固定化酶的酶活力变化（图3）.游离的乙醇脱氢酶在碱性条件下酶活力较高，但当pH值高于9.0后，酶活力急速下降；而固定化醇脱氢酶在较高pH值的环境下反而有更高的酶活性.由于壳聚糖为阳离子型载体，其表面具有游离氨基，固定化酶周围的微环境呈弱碱性，因而固定化酶的最适作用pH值明显高于游离酶.并且固定化酶的空间结构受载体的影响，也降低了其对pH值变化的敏感性.

2.3固定化乙醇脱氢酶的热稳定性

分别在不同的温度条件下将游离酶和固定化酶处理后测其酶活力（图4）.游离的乙醇脱氢酶最适温度在40 ℃左右，超过50 ℃后酶活力急剧下降，温度超过60 ℃后游离酶活力接近于0.而壳聚糖固定化乙醇脱氢酶与游离酶相比其耐热性明显增强，固定化酶在较高的温度范围内保持有较高的活性，在80 ℃左右时，固定化酶仍具有较高的酶活力，这表明固定化酶的热稳定性明显提高.

2.4金属离子对固定化乙醇脱氢酶酶活力的影响

研究金属离子对固定化酶酶活力的影响，分别配置物质的量浓度为10-2mol/L和10-3mol/L两种不同K+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+以及Ca2+溶液，称量适量的游离酶溶液以及固定化酶加入其中，分别测其酶活力.由图5可知，两种不同物质的量浓度的Cu2+金属离子溶液对游离酶都有强烈的抑制作用，而对固定化乙醇脱氢酶的抑制作用则较为微弱.由此可见，固定化酶对Cu2+的稳定性较之游离酶有明显的提高，固定化降低了酶对外界环境的敏感性，能更大程度地发挥酶的活性.

2.5固定化乙醇脱氢酶的半衰期

将固定化酶分别悬浮在pH=9.0和pH=10.0的缓冲液中，并进行连续12次使用的操作，测定每次使用后的酶活力（图6）.壳聚糖固定化乙醇脱氢酶具有较长的半衰期，在pH=9.0条件下，重复使用8次后，固定化酶酶活力虽随着次数的增加有所降低，但仍保持55%的酶活，且表现出较高的稳定性.在pH=10.0条件下，固定化酶稳定性相对较低，在第1次使用后酶活力下降较快，高酶活力的优势不再明显.相对于游离酶而言，固定化酶在使用中具有较好的稳定性，半衰期较长，更加经济耐用.

3结论

固定化酶的研究一直是酶学上研究的重要方面[17]，乙醇脱氢酶在工业上的应用很广泛.本研究表明，壳聚糖固定化乙醇脱氢酶与游离的乙醇脱氢酶相比，在较广泛的温度范围和pH值范围内都有较高的酶活和稳定性，Cu2+对固定化酶酶活力抑制作用微弱，且固定化酶在操作过程中具有较好的重复使用性，在经过多次重复使用后仍然保有较高的催化活力.因此，壳聚糖固定化乙醇脱氢酶有望在实际生产中得到广泛应用.

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Study of enzymatic properties of Chitsanimmobilized

Alcohol Dehydrogenase

LI Xue， ZHANG Caiyan， TONG Kaichen， MA Zhongliang

（College of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444，China）

Abstract：

Taking free enzyme as control，we investigated the enzymatic properties of immobilized alcohol dehydrogenase using chitosan as carrier and glutaraldehyde as crosslinking agent.The results showed that the resistance of immobilized alcohol dehydrogenase to temperature，alkaline environment and Cu2+ was significantly improved when the chitosan was crosslinked with 0.6% glutaraldehyde for 6 hours，and the operation stability was also obviously improved.

Key words：

chitosan； alcohol dehydrogenases； immobilized enzyme

（责任编辑：顾浩然）