首页 >作文大全 >

蚯蚓粪中放线菌分离及其抗菌活性研究

蚯蚓粪中放线菌分离及其抗菌活性研究

2022-03-12 08:44:04 | 浏览次数：

zoޛ)j馝zJnydmrn۽dni`]vJަ&Ǭr+`]J,jlz؜n܉؜i؜jQ')zg %'+r.~`vzǚBz{^+whnz.Ǭn'j)z@Rxz""j}Mv ki--"{aZrاlz׬ފ%jם~&&-o+ZnWrx&zht hjV+')'0zy.[^jnZgR"b+,z{b~'mv梺aZ ɩn*q\r׫brƬejzJzǪyڗ+"8^.,vZnibq^z+(^w^~^j{b'+--^-ڊ{0'!i({l~מ(}eڊ{kj)fuhZvڞئn&ib+r"r.[z0Z~yا&*'Ήޡfw}f-hbazkj)`]a^hjV++h"[Xjwm视&*'Ήv&z׫6ijǝ{az'^؟ƭ~kj)+a(!ib+rl'^؟Z+kzh'Z޺Ȭl*,qbrazkj)`]܉؜-ܩuZbq[jȬ~ߺazڵ槶&r׫inr۬y譸"q\{k_餧Šݲ'(,hjV+&)'"ZbujبivӍ#ri^tO?m`Ym˩m`im˩m`ym˩m`. e˩[`m5p4N[l-im˩x[l-ym˩iV"http://www.wufanghuizhong.com/p/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料

采集时间为2013年8月16日，挑选蚯蚓刚产生的尚未干燥，颜色为黑色，大小均匀的新鲜蚯蚓粪便，用镊子轻轻夹入无菌的纸袋中，带回实验室进行分离。采集地点皖西学院校园的竹林内。

藤黄八叠球菌Micrococcus luteus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、大肠杆菌Escherichia coli、黑曲霉Aspergillus niger均由本实验室保存的菌种。

放线菌分离培养基为改良高氏2号培养基<sup>[14]</sup>;放线菌纯化和菌种保存培养基为高氏1号培养基;细菌抗菌活性测定采用牛肉膏蛋白胨培养基;真菌抗菌活性测定采用马丁氏培养基<sup>[15]</sup>。

2方法

2.1蚯蚓粪预处理

采回的蚯蚓粪连同纸袋放入120 ℃的烘箱内进行干燥加热处理1 h后，用试剂瓶轻轻把蚯蚓粪碾成粉末。在装有玻璃珠的90 mL无菌生理盐水锥形瓶中加入10 g蚯蚓粪粉末，同时，向瓶中滴加1 mL 10%的石炭酸，置于摇床上震荡1 h，充分混匀。

2.2蚯蚓粪放线菌的分离

取1 mL蚯蚓粪悬液至装有9 mL无菌生理盐水的试管中，充分震荡摇匀后，制成1×10-1倍蚯蚓粪悬液，按同样方法依次稀释成1×10-2，1×10-3倍蚯蚓粪悬液。分别用无菌吸量管吸取1×10-1，1×10-2，1×10-3倍蚯蚓粪悬液0.2 mL置于改良高氏2号培养基平板中央，用玻璃涂布器涂抹均匀。每个浓度做3块平板，倒置于28 ℃恒温恒湿培养箱中培养14 d。

2.3放线菌的纯化与菌种保存

把2.2培养蚯蚓粪悬液涂布平板每2 d观察1次，并把新长出的放线菌接种到高氏1号培养基平板上进行纯化培养，如果传代的平板菌落不纯，继续接种、传代培养，直至菌落大小、颜色和形状等特征一致;并把纯化的菌落接种至高氏1号培养基斜面上进行菌种编号，置于4 ℃低温保存。

2.4蚯蚓粪放线菌抗菌活性测定

指示菌平板的制备，分别吸取0.5 mL的M. luteus，B. subtilis，E. coli菌悬液置于50 mL已熔化后冷却至45 ℃左右牛肉膏蛋白胨培养基中迅速摇匀后倒在直径为150 mm培养皿中，制备成混菌平板;同样的方法吸取A. niger的菌悬液至马丁氏培养基中，制备成混菌平板。将2.3分离纯化到的所有放线菌分别接种到高氏1号平板上于28 ℃培养7 d后，分别用内径为6 mm的无菌打孔器制备放线菌菌饼，置于4种指示菌平板的对应的位置处进行抗菌实验<sup>[16]</sup>。M. luteus，B. subtilis，E. coli的指示菌置于37 ℃的培养箱中培养24 h，A. niger平板置于28 ℃的培养箱中培养72 h。观察并记录实验现象和实验结果。

2.5蚯蚓粪中抗菌活性放线菌菌株鉴定

根据2.4抗菌活性筛选结果，选取有较高抗菌活性的放线菌菌株进行形态学和分子生物学鉴定。

2.5.1形态培养特征、生理生化特性和碳源利用情况的研究将放线菌菌株以划线接种至高氏平板上，在划线部位以45°斜插入盖玻片于28 ℃进行培养5～20 d，定期显微观察并记录形态特征<sup>[17]</sup>。参照Shirling<sup>[18]</sup>的方法对其培养特征、生理生化特性和碳源的利用情况进行研究并记录结果。

2.5.2分子生物学鉴定DNA提取和PCR扩增参照Chun等的方法<sup>[19]</sup>。16S rDNA序列PCR扩增采用保守引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）。PCR扩增产物由上海生工生物工程有限公司完成纯化和测序工作。

序列测定结果在Bankit上依次完成序列提交和菌株的相关数据、选取并下载与目标菌株测定序列相似性高的菌株系列;目标菌株序列和相似性高的菌株序列用Clustal X 1.81软件进行序列比对;最后采用MEGA 5.0软件构建系统发育树。

3结果和分析

3.1蚯蚓粪中放线菌分离

在改良高氏2号培养基平板上选取的菌落小、较为干燥、菌落不透明、带有明显的泥腥味、与培养基结合较为紧密的菌落，并且在显微镜下观察为丝状交织的菌丝结构，因此，能够确认分离到的微生物均为放线菌，而不是细菌或霉菌。

由改良高氏2号平板分离，高氏1号平板纯化，共分离得到放线菌26株，依次编号为QYF01～QYF26，并在高氏1号斜面上保藏。

3.2具有抗菌活性蚯蚓粪放线菌测定

通过对4种指示菌株的抗菌实验，26株放线菌中共有16株能对1种或几种指示菌具有抗菌效果，占总分离放线菌的61.54%，具体抗菌活性见表1、图1。由表1可以看出，蚯蚓粪中所分离出的放线菌对M. luteus的抗菌效果最好，共有15株菌具有不同的抗菌能力，以QYF22，QYF12抗菌能力最强，其抑菌圈直径分别为31，27 mm;其次，分离出的放线菌对B. subtilis抗菌效果较好，共有9株菌具有不同的抗菌能力，以QYF26抗菌能力最强，其抑菌圈直径分别为21 mm;但是所分离得到的放线菌对指示菌E. coli，A. niger抗菌能力最差，分别有2，3株，并且形成的抑菌圈直径也较小。

3.3具有较强抗菌活性3株放线菌鉴定

3.3.1放线菌的形态特征QYF12在高氏1号平板上气生菌丝为灰色，基内菌丝为浅黄色，孢子丝为较为紧密的螺旋形，螺旋3～7环，孢子的表面粗糙、呈椭圆形，产生黄色可溶性色素。QYF22气生菌丝为白色，基内菌丝无色，孢子丝为紧密的螺旋形，螺旋3～5环，孢子的表面光滑、呈长圆形，无可溶性色素产生。QYF26为灰褐色气生菌丝，基内菌丝为黄色，孢子丝为波曲状、较长，孢子的表面粗糙、呈球状，产生黄色可溶性色素。

3.3.2菌株的培养特征菌株在8种不同培养基上培养特征见表2。该菌株气生菌丝颜色以白色占优势，产色素居多。

3.3.3生理生化特性和碳源的利用3株放线菌生理生化和碳源利用实验结果见表3。3株放线菌在18～37 ℃均可正常生长，50 ℃以上几乎不能生和黑色素。菌体生长适宜pH 5.0～9.0，最适生长pH 7.0。

3株放线菌碳源利用方面的特性：菌株QYF12可以利用所有实验项目，但是对L-山梨醇和乳糖利用效果较差;菌株QYF22不能利用D-木糖、蔗糖和L-山梨醇;菌株QYF26不能利用蔗糖。表明3株放线菌对碳源利用情况是比较广泛的。

3.3.416S rDNA 序列测定和系统发育树的建立3株放线菌菌株QYF12，QYF22，QYF26经测序后的16S rDNA序列的核苷酸全长分别为1 384，1 405，1 383 bp;提交到GenBank的Bankit后得到的基因登录号依次为KJ676098，KJ676096，KJ676097。菌株QYF12，QYF22，QYF26序列提交到GenBank数据库中Blastn结果表明，同源性最高的菌株分别为教酒链霉菌Streptomyces chartreusis，吸水链霉菌奥萨霉素亚种S. ossamyceticus、灭癌素链霉菌S. gancidicus。分别选取相似性高的菌株16SrDNA 序列进行比较，经Clustal X软件进行aligment后，以MEGA 5.0软件构建出其系统发育树，见图2。在进化树中菌株QYF12，QYF22，QYF26分别与S. chartreusis（AJ399468），S. ossamyceticus（NR041156）和S. gancidicus（JX042473）进化距离最近，并且处于同一分支上。

分支上的树值为自举1 000次的结果，线段0.01代表1/100进化距离单位。

QYF12，QYF22，QYF26 3株放线菌具有典型的链霉属的特征，根据其形态学、培养特征和生理生化特征的研究结果<sup>[20]</sup>，结合分子生物学的鉴定研究，鉴定结果依次为教酒链霉菌S. chartreusis、吸水链霉菌奥萨霉素亚种S. ossamyceticus、灭癌素链霉菌S. gancidicus。

4讨论

适当的前处理与合适的分离培养基可以增加微生物的种类和数量<sup>[21]</sup>。本实验在对蚯蚓粪中放线菌进行分离时发现，当直接用高氏1号培养基分离样品中的放线菌时，得到的放线菌的数量要少于从改良高氏2号培养基分离纯化得到的放线菌数量，估计这是因为改良高氏2号培养基中有机碳含量较少，可以抑制真菌及细菌的生长速度，从而有利于样品中放线菌的分离。同时高温处理样品后得到的放线菌的数量也会增加，120 ℃的高温处理可促进样品中放线菌的分离，故最终选择改良高氏2号培养基作为分离培养基，且样品放置于120 ℃的烘箱内进行干燥加热处理后再进行放线菌的分离。

采用上述方法，本研究从蚯蚓粪中共分离获得放线菌26株，抑菌活性筛选结果表明有16株放线菌对1种或几种指示菌具有抗菌效果，占分离所得放线菌菌株总数的61.54%，其中QYF22，QYF12，QYF26菌株，抑菌活性较强，占分离所得放线菌菌株总数的11.54%。同时也发现本研究中蚯蚓粪放线菌的抑菌活性主要体现在对M. luteus（共有15个菌株表现抑菌活性）与B. subtilis（共有9个菌株表现抑菌活性）上，而对于E. coli和A. niger的拮抗作用相对较差，这与已经报道的从蚯蚓粪中分离出的6个菌株对E. coli具有不同程度的拮抗作用有所不同，表明不同微生物的次级代谢产物不同，抑制对象也会不同<sup>[13]</sup>。

根据形态特征、生理生化的研究结果与16S rDNA序列分析结果，上述3株抑菌活性较强的菌株QYF22，QYF12，QYF26均属于链霉菌属。这与多年以来的研究结果一致，目前在农业和医药上应用的抗生素大多数都来自于链霉菌属菌种，与其他放线菌产生的活性代谢产物相比，链霉菌属产生的微生物天然活性物质最多[7，12-13]。本研究表明了蚯蚓粪放线菌能产生抑菌活性物质，具有较高的开发价值。而QYF22，QYF12，QYF26菌株，由于抑菌圈直径较大，有可能作为潜在的生物防治剂，具有潜在的应用前景，有待于进一步研究。

[参考文献]

[1]马莉， 殷秀琴. 污泥蚯蚓粪对万寿菊生长发育的影响[J]. 应用生态学报， 2010， 21（5）： 1346.

[2]董炜华， 殷秀琴. 蚯蚓在处理活性污泥过程中的生长繁殖[J]. 动物学报， 2007， 53（1）： 69.

[3]Elvira C， Sampedro L， Benitez E， et al. Vermicomposting of sludges from paper mill and dairy industries with Eisenia andrei： a pilot-scale study[J]. Bioresour Technol， 1998， 63（3）： 205.

[4]曾正清， 孙振钧， Kempen T V， 等. 牛粪和蚯蚓粪对猪排泄物中臭气化合物产量的影响[J]. 中国农业大学学报， 2003， 8（3）： 37.

[5]陈玉成， 皮广洁， 黄伦先， 等. 城市生活垃圾蚯蚓处理的因素优化及其重金属富集研究[J]. 应用生态学报， 2003， 14（11）： 2006.

[6]白春节. 低繁殖量蚯蚓养殖法处理剩余污泥的可行性研究[J]. 安全与环境学报， 2006， 6（ 6）： 9.

[7]胡艳霞， 孙振钧， 周法永， 等. 蚯蚓粪对黄瓜苗期土传病害的抑制作用[J]. 生态学报， 2002， 22（7）： 1106.

[8]崔玉珍， 牛明芬. 蚯蚓粪对土壤的培肥作用及草莓产量和品质的影响[J]. 土壤通报， 1998， 29（4）： 156.

[9]吕振宇， 马永良. 蚯蚓粪有机肥对土壤肥力与甘蓝生长、品质的影响[J]. 中国农学通报， 2005， 21（12）： 236.

[10]井大炜. 施用蚯蚓粪对杨树苗根际土壤生物学特征的影响[J]. 水土保持通报， 2014， 34（1）： 133.

[11]赵秋， 高贤彪， 宁晓光， 等. 适用于滨海盐碱土改良剂的应用研究[J]. 西北农业学报， 2014， 23（3）： 107.

[12]胡艳霞， 孙振钧， 王东辉， 等. 蚯蚓粪中拮抗微生物分析[J]. 应用与环境生物学报， 2004， 10（1）： 99.

[13]刘雪连， 张宁， 崔东良， 等. 蚯蚓粪中乳酸菌的分离及其在大肠杆菌O157：H7中的抗菌活性[J]. 基因组学与应用生物学， 2011， 30（1）： 1.

[14]姜怡， 段淑蓉， 唐蜀昆， 等. 稀有放线菌分离方法[J]. 微生物学通报， 2006， 33（1）： 181.

[15]沈萍， 陈向东. 微生物学实验[M]. 北京： 高等教育出版社， 2007： 241.

[16]闵长莉， 汪学军， 刘文博. 春兰内生真菌的分离及其抑菌活性的初步研究[J]. 西北植物学报， 2012， 32（3）： 596.

[17]Stackebrandt E， Rainey F A， Ward-Rainey N L. Proposal for a new hierarchic classification system Actinobacteria classis nov[J]. Int J Syst Bacteriol， 1997， 47（2）： 479.

[18]Shirlinge E B， Gittlieb D. Methods for characterization of streptomycetes species[J]. Int J Syst Bacteriol， 1966， 16（3）： 313.

[19]Chun J， Goodfellow M. A phylogenetic analysis of the genus Nocardia with 16S rRNA gene sequences[J]. Int J Syst Bacteriol， 1995， 45（2）： 240.

[20]中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册[M].北京：科学出版社， 1975： 174.

[21]司美茹， 薛泉宏， 来航线. 放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究[J]. 微生物学通报， 2004， 31（2）： 61.

[责任编辑吕冬梅]

推荐访问： 放线菌 蚯蚓 抗菌 活性 分离
  • 上一篇: 长白山北坡森林土壤低温真菌的种群分布
    •
  • 下一篇:少数民族蒙药学专业有机化学教学改革探索