何首乌不同溶剂提取液的体外抑菌活性研究

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 何首乌块根，购于临海市临江大药房，经70 ℃烘干后研磨成粉末，贮存于干燥皿中。

1.1.2 供试菌株与培养基 供试菌株为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克氏菌（Klebsiella pneumoniae）、大肠杆菌（Escherichia coli），均由浙江省台州医院惠赠，为临床分离菌株。牛肉膏蛋白胨培养基按文献[9]配制，121 ℃高压灭菌20 min备用。

1.1.3 主要仪器 HVE-50型高压灭菌锅（日本Hirayama Manufacturing公司）；YJ型医用净化工作台（苏州洁净技术研究所）；RE-52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DNP-9272型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备公司），QYC-2102C型全温培养摇床（宁波江南仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 何首乌提取液制备 称取何首乌粉末100 g，分别用60%丙酮、70%乙醇和沸水3种溶剂浸提，反复多次，直至浸出液颜色变淡为止。将浸出液合并浓缩至80 mL，用NaOH调pH至7.0，定容至100 mL，制成浓度为1 000 mg/mL的何首乌提取液，提取液过0.22 μm滤膜除菌，贮存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 菌液的制备 菌种接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃活化24 h后取50 μL接入5 mL牛肉膏液体培养基中，30 ℃培养6 h后，取出稀释104、105、106倍，涂牛肉膏蛋白胨平板，30 ℃倒置培养24 h，统计菌落。

1.2.3 抑菌圈的测定 用滤纸片琼脂扩散法测定何首乌不同溶剂提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和肺炎克氏菌的抑菌活性。将直径为6 mm的无菌滤纸片分别置于何首乌乙醇提取液、丙酮提取液和沸水提取液中浸泡20 min。将菌液稀释至106 CFU/mL，取100 μL涂平板，于培养箱内倒置培养15～20 min，待培养基表面干燥后，分别贴上已浸泡过的滤纸片，每处理4个重复，于30 ℃恒温培养24 h，测量抑菌圈直径。以涂布100 U/mL硫酸链霉素溶液为的阳性对照，以涂布无菌水的为阴性对照。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定 用平板二倍稀释法测定丙酮提取液和乙醇提取液对4种供试菌的抑菌效果。分别配制提取液终浓度为200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg/mL的牛肉膏蛋白胨平皿固体培养基，每组4个重复。平皿中涂布活化后的菌液（104 CFU/mL）20 μL， 30 ℃倒置培养24 h，进行菌落计数，与对照（无菌水）相比计算抑菌率。以没有供试菌生长的最小浓度为提取液的MIC。

1.2.5 最低杀菌浓度（MBC）的测定 用试管二倍稀释法测定丙酮提取液和乙醇提取液对4种供试菌的杀菌效果。配制提取液终浓度为500.0、250.0、125.0、62.5 mg/mL的试管液体培养基，每组4个重复。每支试管中加入菌液（105 CFU/mL）100 μL，30 ℃振荡培养3、6、12 h后，分别取培养液20 μL，涂布于牛肉膏固体平板上，30 ℃倒置培养24 h后进行菌落计数，与对照（无菌水）相比计算杀菌率和最低杀菌浓度（MBC）。以平板上菌落少于5个的最小浓度为提取液的MBC。

1.2.6 数据统计分析 数据用Excel、SPSS 13.0软件辅助处理，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 何首乌不同提取液的抑菌效果

滤纸片琼脂扩散法测定结果（表1）显示，何首乌3种溶剂提取液对4种供试菌株均有明显的抑制作用，丙酮提取液和乙醇提取液抑菌效果优于沸水提取液。对于金黄色葡萄球菌和肺炎克氏菌，丙酮提取液和乙醇提取液的抑菌圈均显著大于沸水提取液；对于大肠杆菌，丙酮提取液的抑菌圈最大，显著大于沸水提取液；对于绿脓杆菌，乙醇提取液的抑菌圈最大，显著大于沸水提取液。

2.2 何首乌不同提取液的最低抑菌浓度

2.2.1 丙酮提取液的最低抑菌浓度 何首乌丙酮提取液最低抑菌浓度的测定结果（表2）显示，何首乌丙酮提取液对4种供试菌株的抑菌效果不尽相同。最低抑菌浓度，金黄色葡萄球菌为50.0 mg/mL，大肠杆菌为100.0 mg/mL，绿脓杆菌和肺炎克氏菌均为200.0 mg/mL；在未达到完全抑制的浓度下，抑菌效果随着提取液作用浓度的降低而显著降低。在提取液浓度为50.0 mg/mL时，抑菌效果从高到低依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克氏菌、绿脓杆菌，100.0 mg/mL提取液也表现出相近情况。

2.2.2 乙醇提取液的最低抑菌浓度 乙醇提取液的最低抑菌浓度测定结果（表3）显示，何首乌乙醇提取液对4种供试菌株的抑菌效果不同。对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度为100.0 mg/mL，对其他3种均为200.0 mg/mL；在未达到完全抑制时，抑菌效果随着提取液作用浓度的降低而显著降低。在提取液浓度为25.0 mg/mL时，抑菌效果从高到低依次为金黄色葡萄球菌、肺炎克氏菌、绿脓杆菌、大肠杆菌，100.0、50.0 mg/mL提取液也表现出类似情况。

2.3 何首乌提取液的最低杀菌浓度

何首乌丙酮提取液的最低杀菌浓度测定结果（表4）显示，丙酮提取液对4种供试菌均有一定的杀菌效果。在提取液浓度为500.0 mg/mL时，杀菌率均超过96%；而浓度低于500.0 mg/mL时，只有对金黄色葡萄球菌的杀菌率能达到95%，且随着作用浓度的降低，杀菌效果显著下降。随着培养时间的延长，作用浓度为500.0 mg/mL时的杀菌率总体上略为提高，其他浓度则明显下降，其中3 h与12 h的差异达到显著水平，说明丙酮提取液的杀菌效果不仅决定于浓度，还与培养时间有一定的关系。

何首乌乙醇提取液的最低杀菌浓度测定结果（表5）显示，乙醇提取液对4种供试菌株均有一定的杀菌效果。在提取液浓度为500.0 mg/mL时，杀菌率均超过96%；在低于500.0 mg/mL时，杀菌率均未达到95%，且随着作用浓度的降低，杀菌效果显著下降。随着培养时间的延长，浓度为500.0 mg/mL时总体上杀菌率略为提高，其他浓度则明显下降，其中3 h与12 h的差异达到显著水平，说明乙醇提取液的杀菌效果不仅决定于浓度，还与培养时间有一定的关系。

3 小结与讨论

何首乌具有抗菌、抗氧化、抗衰老、抗动脉粥样硬化、降血脂以及提高免疫系统功能等多种作用，临床上主要用于治疗高血脂[10，11]。何首乌水煎液对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、宋内氏痢疾杆菌、伤寒杆菌等均有不同程度的抑制作用，其有效作用成分可能是蒽醌类化合物及其衍生物[12]。本研究采用丙酮、乙醇和沸水3种溶剂对何首乌块根进行提取，结果表明，3种溶剂提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和肺炎克氏菌均有明显的抑制作用，且丙酮提取液和乙醇提取液作用效果优于沸水提取液。说明何首乌块根中主要抑菌成分可能是脂溶性的，如醌类化合物及其衍生物；但沸水提取液也有一定的抑菌作用，说明何首乌的抑菌物质还包含一些水溶性成分。何首乌中主要活性成分二苯乙烯苷具有良好的水溶性，沸水提取液表现出的抑菌活性可能与二苯乙烯苷类有一定的关系，具体情况有待进一步研究。丙酮提取液和乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌浓度分别为50.0和100.0 mg/mL。但最低杀菌浓度检测显示，在作用浓度低于500.0 mg/mL时，培养液中的活菌数随培养时间延长呈现增加趋势，说明两种提取液的主要作用是抑菌。丙酮提取液和乙醇提取液杀菌效果不仅取决于浓度，且与作用时间、菌株有一定的关系，提示临床用药要综合考虑药物的作用时间、浓度和所针对的菌株。

参考文献：

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