丹参总酚酸抑制酪氨酸酶机理研究

材料

1.1 仪器

Multiskan Mk3型酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司），LDZ4-0.8离心机（北京医用离心机厂），RE-52AA旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技有限公司），DZKW-D-4型电热恒温水浴锅（上海树立仪器仪表有限公司），UV-5500型紫外-可见分光光度仪（上海元析仪器有限公司）。

1.2 药品

酪氨酸酶（合肥博美生物科技有限责任公司，批号：34B14750），左旋多巴（合肥博美生物科技有限责任公司，批号：B150255 ），PBS缓冲溶液（自配，A液每1L含NaH2PO4·2H2O 7.80g，B液每1L含Na2HPO4·12H2O 17.80g），磷酸二氢钠，磷酸氢二钠为分析纯，水为超纯水，丹参药材（购自济南建联大药房，经山东中医药大学李保国副教授鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge）。

2 方法和结果

2.1 丹参酮、丹参总酚酸制备

丹参加11倍量水，浸泡30min，80℃水浴回流提取2次，第一次提取2h，第二次提取1.5h，合并滤液，60℃减压浓缩至相对密度1.18～1.22，放冷，加乙醇使含醇量达到70%，4℃静置12h，虹吸上清液，减压回收乙醇，至稠膏状，干燥，即得丹参总酚酸提取物[1，6]。

丹参加8倍量90%乙醇，80℃回流提取2次，每次1h。滤过，合并滤液，60℃减压回收乙醇并浓缩至相对密度1.30～1.35，用热水洗至洗液无色，干燥，即得总丹参酮提取物[1，7]。

2.2 供试液配制

2.2.1 PBS缓冲液配制：精密称取磷酸二氢钠7.80g，用超纯水定容至1L，为A液。精密称取磷酸氢二钠17.80g，用超纯水定容至1L，为B液。121℃热压灭菌30min，使用时取等体积的A，B液体混合均匀，即得ph=6.8的PBS缓冲液。

2.2.2 酶溶液配制：精密称取酪氨酸酶4.60mg，用PBS缓冲液定容至10ml，摇匀，精密移取400μl，用PBS定容至10ml，即得浓度为0.0184mg·ml-1的酶溶液。

2.2.3 左旋多巴溶液配制：精密称取左旋多巴70.3mg，用PBS缓冲液定容至100ml，摇匀，超声10min，滤过，即得浓度为0.703mg·ml-1的左旋多巴溶液。

2.2.4 丹参总酚酸溶液配制：取丹参总酚酸提取物约10g，精密称定，用PBS缓冲液定容至100ml，摇匀，超声10min，3 000r·min-1离心10min，取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得浓度为100mg·ml-1丹参总酚酸溶液。

2.3 总丹参酮、丹参总酚酸对酪氨酸酶的抑制效果

取丹参总酚酸提取物约100mg，精密称定，用PBS缓冲溶液溶解，并定容至10ml。取总丹参酮提取物约20mg， 精密称定，用1%吐温-80PBS缓冲液定容至10ml。用96孔板进行试验，试验方法见表1。

按表1加完试液后30℃反应10min，加入左旋多巴溶液200μl，30℃反应10min，用酶标仪测定吸光度，每组6个平行孔，求每组吸光度差值ΔA并计算平均值，数据以（x±s）表示，对结果进行t检验（双侧），用SPSS 17.0统计软件进行处理，并计算抑制率，抑制率公式为：抑制率=（1-加药组/空白组）×100%。结果见表2，丹参总酚酸组与空白对照组对比具有显著性差异（P<0.05），总丹参酮组无显著性差异（P>0.05），丹参总酚酸提取物对酪氨酸酶的的抑制率为28.57%，总丹参酮提取物对酪氨酸酶的抑制率为0.00%。

2.4 丹参总酚酸对酪氨酸酶的抑制作用机理

2.4.1 酪氨酸酶的Km和Vmax测定：分别精密移取左旋多巴溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0ml，用PBS缓冲液定容至10ml。A组为空白对照组，B组为实验组。A1到A10加入等体积不同浓度的左旋多巴溶液，B组按序号对应，加入与A组相同的左旋多巴溶液，按表3进行实验。30℃反应10min，用紫外-可见分光光度计测定490nm波长处的吸光度A。反应速度v=A/t，以底物浓度[S]为横坐标，以吸光度变化速率v为纵坐标，绘制v-[S]曲线，见图1，Km值在0.2mg·ml-1附近。

根据酶学知识，底物浓度在0.3Km至2.0Km范围内为合理浓度。因此选择0.0703，0.1406，0.2109，0.2812，0.3515mg·ml-1的5组数据带入Lineweaver-Burk双倒数方程，得方程1/v=-9.311/[S]+45.045，（r=0.9992），由方程可求出Km=0.2067，Vm=0.0222·min-1。

2.4.2 丹参总酚酸对酪氨酸酶可逆抑制研究：根据酶学实验文献[8]，固定底物左旋多巴的量，改变酶量，测定不同浓度丹参总酚酸对酪氨酸酶催化速率的影响，在96孔板中加入酪氨酸酶溶液50，60，70，80，90μl，用PBS缓冲液补加至150μl。空白组设为A加100μl的PBS缓冲液，实验组设为B、C、D、E加100μl不同浓度丹参总酚酸溶液，30℃反应10min，然后加入100μl的左旋多巴溶液，30℃反应10min，立即测定吸光度值。不同酶浓度做3个平行孔，求均值。以吸光度变化速率为纵坐标，酶量为横坐标，进行线性回归，结果，随着丹参总酚酸浓度的增大，直线的斜率降低，见表4。

2.4.3 可逆抑制作用类型考察：采用Lineweaver-Burk双倒数作图法来判断抑制作用类型[9]，固定加酶量，改变测定体系中底物左旋多巴量和丹参总酚酸的浓度。精密移取2.2.3项下左旋多巴溶液2、4、6ml，用PBS缓冲液定容至10ml。精密移取2.2.4项下丹参总酚酸溶液0.5、1.0、1.5、2.0ml，用PBS缓冲液定容至10ml。在96孔板上每孔加入50μl酪氨酸酶溶液，同列加入100μl相同浓度的丹参总酚酸溶液，且丹参总酚酸浓度由左向右递增，最左侧设置空白对照孔，加100μl的PBS缓冲溶液，30℃反应10min，所有孔均加入200μl的L-DOPA溶液，30℃反应10min，用酶标仪测定吸光度。用Lineweaver-Burk双倒数作图法，以1/[S]为横坐标，1/v为纵坐标，进行线性回归。线性方程见表5。

3 讨论

皮肤颜色不佳的确切原因及机制目前尚不清楚，一般认为其主要与内分泌失调、紫外线照射等因素有关。在正常生理状态下，皮肤内黑色素的生成和排泄呈动态平衡。暗黄的皮肤大多由于黑色素生成大于排泄，皮肤中黑色素的不断累积。酪氨酸酶是调控人体黑素色产生的关键酶，因此，美白的关键点是抑制酪氨酸酶的活性 。改善肤色令皮肤焕发出自然光彩有两个着力点，一减少黑色素生成，二加快黑色素清除。丹参总酚酸能够抑制黑色素的生成；同时，丹参通过改善微循环可以加快黑色素清除。从两个方面帮助皮肤重新恢复动态平衡。

在实验中随着丹参总酚酸浓度的增大，直线的斜率降低，如表4所示，说明丹参总酚酸对酪氨酸酶的抑制作用属于可逆过程。丹参总酚酸通过降低酪氨酸酶的催化效率而导致酶活力下降，不是减少有效酶量而引起酶活力下降。因此丹参美白基本不存在不可逆转的副作用，如有不适停止使用可恢复。

丹参总酚酸浓度超过10mg·ml-1后，米氏常数Km变大，最大反应速度Vmax变小，如表5所示，因此抑制机理为混合I型。阐明抑制机理可以使丹参美白产品的制造和使用有据可依，也为丹参药妆的研究提供理论基础。

总丹参酮对酪氨酸酶没有抑制作用，而且对皮肤有很强的色素附着，难以洗除，因此，美白产品中不宜添加总丹参酮。

综上所述，丹参美白的有效部位是丹参总酚酸。因此，丹参作为美白化妆品原料时，应该使用水作为提取溶剂，这既有利于提取有效成分，也更加经济。这对于实际生产有一定的指导意义。

21世纪多学科交叉发展，使国际高端化妆品研究走向多层次、整体化。本文将医学、中药学、美容学相互融合提出了中药美白化妆品研制的新思路。医学与美容学结合，可以使美容学更安全，更完善。中药学与美容学结合，可以生产出功能性化妆品。本文研究丹参总酚酸对酪氨酸酶的抑制作用机理，从酶学层面阐释了丹参用于美白的可能性，为丹参美白护肤品的研制提供实验依据。不仅如此，在后续研究中还可以将本文中的方法作为一种快速、经济、灵敏的检测手段。

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[9]Hans Bisswanger.Practical Enzymology[M].The first edition，WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA，2004，1：8-15.

[收稿日期]2015-08-10 [修回日期]2015-10-23

编辑/张惠娟