不同产地苍耳子UPLC指纹图谱研究

材料

Waters Acquity UPLC（ultra-performance liquid chromatography） H-Class超高效液相色谱系统， 配有四元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、柱温箱、PDA测器和 Empower 2 色谱工作站（美国Waters公司）；1/10万电子分析天平（AG285型，德国赛多利斯公司）。超声仪（KQ-3200B型，江苏昆山超声仪器有限公司）；中药粉碎机（HFB-200型，吉首市中州市中药机械厂），真空干燥箱（DZF-6050型，上海博讯医疗设备厂）。

乙腈为色谱纯（Dikma Techologies INC，USA）；甲醇、磷酸等试剂均为分析纯；屈臣氏蒸馏水； 0.22 μm微孔滤膜（北京八方世纪科技有限公司）。绿原酸（110753-200413）和咖啡酸（110885-200102）购自中国食品药品检定研究院；1，3-二咖啡喹啉酸（11042905），原儿茶醛（1103006），3，4-二咖啡喹啉酸（12041114），3，5-二咖啡喹啉酸（12101101），4，5-二咖啡喹啉酸（11081803），隐绿原酸（11112203）和新绿原酸（11112202）均购自成都曼斯特化工有限公司提供，经¹H，¹³C-NMR，MS，IR和UV等光谱检测确认其结构；按归一化法测得其纯度均≥98%。苍耳子药材于2012年9—11月采于全国不同省份的原产地，经安徽中医药大学第一附属院韩燕全副主任中药师鉴定均为菊科植物苍耳X. sibiricum的成熟带总苞的果实，采收后60 ℃真空干燥至恒重，密封保存，临用前粉碎过40 目筛，苍耳子样品信息见表1。

表1 26批不同产地苍耳子药材UPLC指纹图谱共有峰的相似度

Table 1 Similarity results of UPLC fingerprint of Xanthii Fructus from 26 habitats

2 方法

2.1 色谱条件

Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱程序为： 0～2 min，3%A；2～2.5 min，5%A；2.5～8 min，10%A；8～8.5 min，15%A；8.5～14 min，20%A；14～17 min，24%A；17～20 min，35%A；20～22 min，50%A；22～23 min，3%A；检测波长220 nm，流速0.25 mL·min^-1，柱温30 ℃，进样量1.0 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称定上述9种化学对照品适量，分别置于棕色量瓶中，以色谱甲醇溶解并稀释至刻度，制得对照品储备液。分别取对照品储备液各一定量置10 mL棕色量瓶中，作为对照品稀释液；再分别取对照品稀释液一定量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得终质量浓度分别为4.573，10.120，44.400，3.093，2.680，2.507，3.613，29.333，9.480 mg·L^-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取苍耳子药材粉末0.3 g，置于10 mL棕色量瓶中，加入甲醇称定质量， 超声提取30 min（150 W，40 Hz），放冷，称定质量，加甲醇补足损失质量，摇匀，再次静置，临用前用0.2 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察 精密吸取S9号（河南汤阴县郊产）样品溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，记录指纹图谱，19个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.05%～0.21%，0.35%～1.5%，以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004版A）评价，6次进样的相似度均>0.998，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱测定的要求。

2.4.2 重复性试验 称取S1号（安徽亳州谯城区）供试品6份，每份0.3 g左右，按2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下的色谱条件进样，记录色谱图。结果表明，19个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.048%～0.69%，0.71%～2.3%，以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004版A）评价，6份样品的相似度均>0.997，表明样品处理方法的重复性较好。

2.4.3 稳定性试验 取S2（安徽合肥市南郊产）供试品溶液，按照2.1项下的色谱条件进样，在0，2，4，8，16，24 h记录色谱图。结果表明，19个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.018%～0.54%，0.83%～2.6%，以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004版A）评价，6个时间点的相似度均>0.995，表明样品溶液在实验过程中稳定。

2.4.4 苍耳子药材UPLC指纹图谱中的特征峰 取不同产地的苍耳子药材，按2.3项下制备样品溶液，在2.1项下色谱条件测定样品的图谱，分别得到26批样品的指纹图谱。根据中国药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004版A）处理图谱，生成苍耳子药材共有模式的对照指纹图谱，见图1，其中共有色谱峰19个。通过对照保留时间，指认了19个峰中的9个峰，分别为1号峰（原儿茶醛），2号峰（新绿原酸），5号峰（绿原酸），6号峰（隐绿原酸），7号峰（咖啡酸），8号峰（1，3-二咖啡酰奎宁酸），12号峰（3，4-二咖啡酰奎宁酸），13号峰（3，5-二咖啡酰奎宁酸），14号峰（4，5-二咖啡酰奎宁酸）。

图1 对照品和苍耳子药材的共有模式图

Fig.1 The chromatogram of reference and total pattern diagram of Xanthii Fructus

2.5 苍耳子药材的UPLC指纹图谱建立

2.5.1 参比峰的选择 在各批次苍耳子样品图谱中以5号色谱峰绿原酸的色谱峰分离良好，峰面积最大且为所有样品共有，所以确定5号色谱峰绿原酸为参照峰。

2.5.2 指纹图谱的建立及相似度评价 将所得的26批苍耳子药材UPLC图谱以AIA格式依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004版A）软件，以第S1批药材图谱作为参照谱进行指纹匹配，确定了19个共有峰，建立了苍耳子药材特征指纹图谱的共有模式，并进行了相似度计算，26批药材的叠加指纹图谱，见图2，各产地苍耳子药材与对照指纹图谱的相似度见表1。除S3，S7，S11，S14和 S18 5批样品的相似度较低（<0.9），其他产地的苍耳子药材相似度较好。

图2 26批苍耳子药材UPLC指纹图谱叠加图

Fig.2 Overlay chart of UPLC fingerprint of Xanthii Fructus from 26 habitats

2.5.3 苍耳子样品聚类分析^[6-7] 将各色谱峰面积相对于称样量量化，运用 SPSS 16.0软件对26 个产地苍耳子样品进行系统聚类，采用组间平均数联结法aveage linkage（ between groups） ，以夹角余弦（cosin） 作为样品相似度的距离公式。根据聚类分析结果，将苍耳子样品大致可分为 6大类：Ⅰ类包括 S2，S15，S16和S25，质量最好；Ⅱ类包括 S11，S12，S17，S19，S20，S22和S24，质量较好； Ⅲ类包括 S13，S21和S23，质量次之； Ⅳ类包括S1，S4，S6和S10，质量较差； Ⅴ类包括S5，S8，S9和S26，质量最差；Ⅵ类包括S3，S7，S10，S14和S18，这5个产地样品各自单独成类，质量或优或劣，差异性较大（比如S3号样品，其峰面积值和出峰数都明显大于其他样品，但单独成类，而其相似度也较低）；聚类分析得到的样品之间的相关性，与相似度计算得到的样品之间的相关性，结果较一致，具体结果见图3。

2.5.4 共有峰主成分分析^[9-10] 用 SPSS 16.0 统计分析软件对原始数据做标准化处理后进行主成分分析，以主成分的特征根及贡献率是作为选择主成分的依据。对26个合格样品（观测对象） 的 19个共有峰（变量） 进行主成分分析，主成分个数

图3 聚类分析结果

Fig.3 Results of hierarchical cluster analysis

提取原则是取主成分对应的特征值大于1的前6个主成分，其累计贡献可以达到81.140%，包含了大部分信息。其中第一主成分特征值为4.697，方差贡献率为24.722%；第二主成分特征值为3.812，方差贡献率为20.064；第三主成分特征值为2.469，方差贡献率为12.996%；第四主成分特征值为1.758，方差贡献率为9.253%；第五主成分特征值为1.505，方差贡献率为7.922%；第六主成分特征值为1.175，方差贡献率为6.182%。分别以第一、第二、第三主成分来建立坐标系，进行投影即可得到所有样本的PCA三维投影图，见图4；图中每个点对应1个共有峰，19个共有峰可分为3类。

图4 主成分得分图

Fig.4 PCA score figure

旋转后的公共因子载荷矩阵见表2，每一个载荷量表示主成分与对应变量的相关系数，经计算可得主成分的模型如下：

A1=-0.046F1-0.042F2+0.015F3+0.025F4+0.048F5-0.079F6-0.108F7+0.0480F8-0.035F9+0.163F10+0.140F11+0.005F12+0.149F13+0.090F14+0.015F15+0.155F16+0.143F17+0.178F18+0.177F19

A2=0.189F1+0.190F2+0.174F3+0.215F4+0.179F5+0.137F6+0.052F7+.037F8+0.146F9-0.003F10-0.047F11+0.034F12+0.019F13+0.155F14-0.060F15-0.050F16+0.029F17+0.051F18+0.032F19

A3=0.162F1-0.101F2+0.195F3-0.101F4+0.092F5+0.248F6+0.289F7-0.249F8-0.152F9+0.079F10+0.006F11-0.098F12+0.080F13+0.086F14-0.114F15+0.148F16-0.110F17-0.025F18-0.002F19

A4=0.060F1-0.035F2+0.167F3+0.016F4+0.205F5-0.009F6-0.019F7-0.126F8-0.026F9+0.075F10-0.086F11+0.465F12+0.081F13-0.269F14+0.278F15-0.102F16-0.038F17+0.105F18-0.0052F19

A5=0.003F1+0.054F2-0.035F3+0.133F4-0.045F5+0.128F6-0.042F7+0.136F8+0.123F9+0.220F10+0.399F11+0.136F12-0.190F13+0.070F14+0.288F15+0.273F16-0.291F17-0.198F18-0.199F19

A6=-0.115F1-0.154F2+0.188F3-0.237F4+0.399F5-0.055F6-0.112F7+0.363F8+0.162F9-0.202F10-0.087F11-0.284F12+0.320F13+0.001F14+0.271F15-0.014F16-0.272F17-0.013F18-0.103F19

A1，A2……A6分别表示 6 个主成分，F1，F2……F19分别表示各个色谱峰的相对峰面积经标准化后的数据。 6个主成分中，A1是特征值最大的，即是“信息量”最多的峰。第一主成分中系数的大小反映了指标成分贡献率的大小，其中前5名变量的系数对应指纹图谱的色谱峰分别是5，3，15，13，17号峰。从对照品色谱图可知，5号峰为绿原酸，13号为3，5-二奎宁酰咖啡酸，3，15，17号峰为未知成分需要进一步的分析确证。

3 讨论

近年研究表明，苍耳子药材提取物中含有大量的酚酸类化合物，包括绿原酸、新绿原酸、咖啡酸和多种咖啡酰奎宁酸类等^[8]，这类化学成分被证实是苍耳子发挥临床疗效的重要药效组分，具有良好的抗菌、抗病毒、消炎、镇痛作用、止咳和抗肿瘤等生物活性。本研究首次建立了不同产地苍耳子的UPLC指纹图谱，明确了苍耳子指纹图谱中的含量较高的主要酚酸类有效成分的峰归属，实验结果对于建立

表2 因子负荷矩阵结果

Table 2 Component score coefficient matrix

科学、合理的苍耳子药材质量评价方法，了解其产地与质量的关系、提高其质量控制标准都具有重要的意义。根据建立的苍耳子药材UPLC指纹图谱，通过相似度评价和聚类分析结果发现，26批不同产地苍耳子药材中，21批药材的指纹图谱相似度在 0.9以上，说明药材质量总体较为稳定；对于实验确立的19个共有色谱峰，通过对照品比对，明确了9酚酸类成分的归属，相似度结果可以基本反映苍耳子药材的质量状况。聚类分析结果中的5批样品指纹图谱相似度较低和无法聚类的原因，应主要与药材的生长环境、条件和采收时间有关，导致酚酸类成分的含量和种类有明显差异。利用主成分分析的降维分析，将反映苍耳子药材指纹图谱的多维特征参数用6个主成分来描述，可用于苍耳子药材指纹图谱数据快速分析，能更辅助判别药材的真伪与优劣，可以作为苍耳子药材质量检测的一种手段。

本实验建立的苍耳子UPLC指纹图谱条件，样品的出峰数目、强度及分离度均较理想，可以较全面反映出样品的化学成分信息，符合指纹图谱研究的技术要求，结合相似度计算、聚类分析和主成分分析对指纹图谱进行综合评价，结果令人满意，为苍耳子药材的质量控制提供了比较直观、简便、全面的评价方法。另外，对于实验中无法聚类的样品的主要差异的色谱峰和PCA-CA选出的部分未知特征成分，尚需进一步结合质谱、药效等手段进行进一步研究，以说明其差异对质量优劣的影响。

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UPLC fingerprint of Xanthii Fructus from different habitats

HONG Yan¹， HAN Yan-quan^2*， XIA Lun-zhu2，GUI Jie¹， CHEN Xi¹， SUN Yan-hua¹

（1. School of Integrated Traditional and Western Medicine，Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230031， China；

2. The First Affiliated Hospital， Anhui University of Chinese Medicine， Grade 3 Laboratory of Traditional Chinese Medicine

Preparation， State Administration of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230031， China）

[Abstract] This study was establish an UPLC fingerprint of Xanthii Fructus from different habitats，to provide a comprehensive evaluation for its quality control. UPLC-PDA was adopted to analysis of 26 baches of Xanthii Fructus from different habitats. The chromatographic condition was as follow： ACQUITY BEH C₁₈ Column （2.1 mm×100 mm，1.7 μm） eluted with the mobile phases of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid water in gradient mode. The flow rate was 0.25 mL·min^-1 and the detection wavelength was set at 220 nm. The fingerprints of 26 batches Xanthii Fructus were carried out by similarity comparation ，cluster and the principal component analysis （PCA）. There were nineteen common peaks，nine of which had been identified，and the similarity degrees of the twenty-six batches of the samples were between 0.804 and 0.990.All the samples were classified into six categories， and the PCA value of each fingerprint peak was calculated， and six principal components accounted for over 81.140% of the total variance were extracted from the original data. This method can be used to assess the quality of Xanthii Fructus。

[Key words] Xanthii Fructus； different habitats； UPLC； chromatographic fingerprint

doi：10.4268/cjcmm20131124

[责任编辑 孔晶晶]