枣树皮提取物的抑菌作用

材料和方法

1.1 材 料

枣树皮：金丝小枣树皮取自河北沧州枣园。马牙枣、红枣树皮取自静海县子牙镇枣园。用清水洗净树皮后，60 ℃烘干，粉碎过孔径0.21 mm的筛备用。

菌种：天津农学院生化实验室保存，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和迟缓爱德华菌。

1.2 试 剂

乙酸乙酯、浓盐酸、氢氧化钠（粒状）、氯化钠购自天津市风船化学试剂科技有限公司；牛肉蛋白胨购自天津艾勒科技有限公司；酵母浸粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉购自上海蓝季科技发展有限公司；无水乙醇购自天津市华东试剂厂。

1.3 仪 器

DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海恒科技有限公司；YS-08型粉碎机，北京燕山正德机械设备有限公司；BSA223S型电子天平，赛多利斯（北京）科学仪器有限公司；P180H型超声波清洗器，Elma-Hans Schmidbauer GmbH； L550型台式低速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 菌种的活化及菌悬液的制备 将保存的5个菌种活化于固体斜面培养基上。大肠杆菌与枯草芽孢杆菌放在37 ℃培养箱中培养，嗜水气单胞菌、温和气单胞菌与迟缓爱德华菌放在28 ℃培养箱中培养。24～48 h后活化完成。将活化好的菌种，用无菌水稀释至菌悬液的浓度为105～106 CFU·mL-1备用。

1.4.2 枣树皮提取物的制备 将枣树皮按料液比1∶15（g·mL-1）加入70%的乙醇进行超声提取。超声功率266 W、60 ℃下提取60 min。提取结束后，4 000 r·min-1离心10 min，将上清液过滤后减压旋蒸，收集提取物粉末备用。

1.4.3 不同提取方法对抑菌效果的影响 （1）浸提法：取金丝小枣树皮粉末，按1∶15料液比（g·mL-1）加入70%乙醇，60 ℃下浸提48 h。（2）水浴回流法：取金丝小枣树皮粉末，按1∶15料液比（g·mL-1）加入70%乙醇，60 ℃下水浴回流6 h。（3）超声波提取法：取金丝小枣树皮粉末，按1∶15料液比（g·mL-1）加入70%乙醇。超声功率266 W，60 ℃下超声提取60 min。取上述3种方法得到的上清液分别过0.22 μm的有机滤膜过滤除菌，以牛津杯法做抑菌实验，比较不同提取方法下的抑菌效果。

1.4.4 不同抑菌方法的比较 （1）牛津杯法（牛津杯的内径为7.5 mm）。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和迟缓爱德华菌用1.4.1的方法制备成菌悬液。用移液枪吸取100 μL菌悬液于LB培养基上，涂布均匀放上牛津杯，静置1 h。待牛津杯底部与培养基表面紧密贴合后，再用移液枪吸取枣树皮提取液于牛津杯中。放入恒温培养箱中培养，观察抑菌效果。

（2）滤纸片法。将滤纸片用7.5 mm内径的打孔器制成小圆片，经过湿热灭菌后放入枣树皮提取液中浸泡48 h后备用。将5种菌涂布在培养基上，将蘸有提取物的滤纸圆片放在培养基表面。放入恒温培养箱中培养，观察抑菌效果。用牛津杯法与滤纸片法分别做3次平行试验，根据抑菌圈大小比较两种方法的抑菌效果。

1.4.5 不同提取溶剂对抑菌效果的影响 选取水、70%乙醇和乙酸乙酯为提取溶剂进行比较。称取3份金丝小枣树皮粉末，每份10 g，分别以水、70%乙醇和乙酸乙酯为提取溶剂。按照1.4.2条件进行超声提取。用牛津杯法进行抑菌试验，根据抑菌圈大小比较各提取溶剂的提取效果。

1.4.6 新树皮与老树皮抑菌效果的影响 选取金丝小枣的新树皮与老树皮粉末通过1.4.2的方法制备提取液。牛津杯法进行抑菌试验，比较二者抑菌圈的大小，分析它们的抑菌效果的强弱。

1.4.7 不同品种枣树皮的抑菌效果的比较 取金丝小枣，马牙枣和红枣3种老树皮粉末通过1.4.2的方法制备提取液。牛津杯法进行抑菌试验，测量出3种枣树皮的抑菌圈的的大小。根据抑菌圈大小比较抑菌效果的差异。

1.4.8 最小抑菌浓度的确定 选用金丝小枣老树皮旋蒸后提取物，采用2倍稀释法对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、和迟缓爱德华菌进行对应的抑菌试验，分析其最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 提取方法对抑菌效果的影响

不同提取方法的抑菌效果见表1。由表1可知， 浸提法提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、温和气单孢菌无抑菌效果，对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华菌具有一定的抑菌效果，抑菌圈平均有效直径达到1.5 mm。水浴法提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、温和气单孢菌无抑菌效果，对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华菌具有一定的抑菌效果，抑菌圈平均有效直径分别达到2，3 mm。超声法提取物对5种菌均具有抑菌效果，抑菌圈平均有效直径范围在0.5～3.5 mm。综合以上3种提取方法的抑菌效果，选定超声法作为后续试验提取方法。

2.2 抑菌方法的比较

牛津杯法与滤纸片法比较结果见表2。由表2可知，滤纸片法得到的抑菌圈直径大小为7.5 mm，本身的直径大小也是7.5 mm，表明滤纸片法对以上5种菌没有抑菌效果。这可能是由于滤纸片贴在培养皿的表面后，由于浸染的提取液主要成分是70%乙醇，乙醇的挥发导致提取液有效成分结晶析出而不能产生抑菌作用。牛津杯法测得枣树树皮提取物在5种菌中的抑菌圈直径分别为8.5，10.6，10.0，8.8，11.2 mm，减去牛津杯外径7.5 mm，即平均有效抑菌直径分别为1.0，3.1，2.0，1.3，3.7 mm。故而选用牛津杯法进行后续的抑菌试验。

2.3 提取溶剂对抑菌效果的影响

由表3可知，水与乙酸乙酯作为提取剂提取的物质对5种菌均无抑菌效果。以70%的乙醇作为提取剂时，提取物对大肠杆菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌具有较弱的抑菌效果，对迟缓爱德华菌和枯草芽孢杆菌有较强的抑菌效果。所以，选用70%的乙醇作为枣树皮的提取溶剂。

2.4 新树皮与老树皮对抑菌效果的影响

由表4可知，金丝小枣老树皮对于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和迟缓爱德华菌的抑菌圈直径都大于金丝小枣新树皮的平均有效抑菌圈直径。金丝小枣新树皮对于迟缓爱德华菌的抑菌效果最强，平均有效抑菌直径为3.0 mm；其次为温和气单胞菌，平均有效抑菌直径为1.0 mm。老树皮对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华菌的抑菌效果强于其它3种菌。这可能是由于老树皮的生长时间相对于新树皮更长，积累的抑菌有效成分会更多。

2.5 不同品种枣树皮抑菌效果的比较

由表5可知，在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和迟缓爱德华菌5种菌的抑菌效果比较中，马牙枣老树皮对5种菌的抑菌效果最差，平均有效抑菌圈直径分别为0，1.0，2.0，2.5，0 mm。金丝小枣老树皮在枯草芽孢杆菌、温和气单胞细菌、迟缓爱德华菌中的抑菌效果较好，平均有效抑菌直径均为3.5 mm。对大肠杆菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果较差。红枣老树皮在大肠杆菌和温和气单胞细菌中的抑菌效果最好，平均有效抑菌直径为3.5 mm，对其它3种菌的抑菌效果较弱。综合分析抑菌效果，金丝小枣老树皮抑菌效果稍强于红枣树皮，马牙枣老树皮抑菌效果最弱。究其原因可能是因为不同种类枣树皮的抑菌成分及其含量有所不同造成。

2.6 枣树皮提取物在5种细菌中最低抑菌浓度的测定

由表6可知，大肠杆菌与温和气单胞菌在稀释2倍后无抑菌效果，故而其最低抑菌浓度为7.5×10-4 g·mL-1。枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华菌在稀释4倍后无抑菌效果，所以其最低抑菌浓度为3.8×10-4 g·mL-1。

3 讨 论

在传统的枣树皮的使用中，多为煎煮内服治疗止泻、研磨成粉外敷愈合烧伤。枣树皮内含有黄酮、单宁等多种有效成分，同时也可能含有萜类、生物碱类、苷类、木脂素、酯类、酚类、醛类、醇类、甾类等抑菌成分，可以利用现代技术工艺加工枣树皮，利用其更大的药用价值。试验表明，枣树皮提取物对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和迟缓爱德华菌这3种水产治病菌都有一定的抑菌效果。所以，在实际的水产养殖中，可以将枣树皮抑菌剂与化学药剂交替使用，防治鱼类疾病，其植物源类抑菌剂绿色安全的特点可以缓解水产品食用安全问题。

4 结 论

采用超声法进行提取枣树皮的有效成分，牛津杯法进行抑菌试验。结果发现，以70%的乙醇作为提取溶剂抑菌效果最好；金丝小枣树皮的老树皮的抑菌效果强于新树皮，且对于大肠杆菌与温和气单胞菌的最低抑菌浓度为7.5×10-4 g·mL-1，对于枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌与爱德华迟缓菌最低抑菌浓度为3.8×10-4 g·mL-1。在不同种类的枣树树皮抑菌效果中，金丝小枣树皮抑菌效果最好，红枣树皮次之，马牙枣树皮最弱。

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