高盐方法提取蒙古黄芪基因组DＮA比较分析

2022-03-25 08:19:29 | 浏览次数：

摘要：为了提取高质量的蒙古黄芪（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）基因组ＤＮＡ，采用高盐十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）法、高盐溴化十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法和高盐低ｐＨ值法，结果表明高盐ＣＴＡＢ法获得的黄芪基因组ＤＮＡ纯度高，能用于ＰＣＲ扩增和限制性内切酶酶切，是提取黄芪基因组总ＤＮＡ的最佳方法。

关键词：高盐；蒙古黄芪；ＤＮＡ提取

中图分类号：Ｒ２８２；Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）03－0595-04

ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｉｇｈ－ｓａｌｔＭｅｔｈｏｄｓｏｆＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍＡｓｔｒａｇａｌｕｓ mｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ

ＨＡＮＹａ－ｎａｎ，ＺＨＡＯＸｉｕ－ｊｕａｎ，ＬＩＹａｎ－ｊｕｎ，ＣＡＩＬｕ

（ＳｃｈｏｏｌｏｆＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓＰｈｙｓｉｃｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｏｔｏｕ０１４０１０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｉｇｈ－ｓａｌｔＳＤＳ，ｈｉｇｈ－ｓａｌｔＣＴＡＢ，ａｎｄｈｉｇｈ－ｓａｌｔｌｏｗｐＨｖａｌｕｅｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙＡｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗｉｔｈｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｑｕａｌｉｔｙｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｈｉｇｈ－ｓａｌｔＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｗａｓｐｒｅｆｅｒａｂｌｅｅｎｏｕｇｈｔｏｂｅｕｓｅｄａｓＰＣＲｔｅｍｐｌａｔｅａｎｄｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ；ｔｈｕｓｈｉｇｈ－ｓａｌｔＣＴＡＢｗａｓｔｈｅｂｅｓｔＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ；Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ；ＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

蒙古黄芪（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）属双子叶植物纲豆科植物，分布于黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西等地，可以补气固表、托毒生肌、利水退肿。治气短心悸、乏力、虚脱、自汗、盗汗、体虚浮肿、慢性肾炎、久泻等疾病［１］。近年来由于环境的恶化、土地盐碱化愈加严重，蒙古黄芪资源逐渐匮乏。因此，高盐环境下蒙古黄芪的生理生化特性及分子生物学研究就变得尤为重要，而进行这些研究的必要前提就是提取高质量的蒙古黄芪基因组ＤＮＡ。提取植物基因组ＤＮＡ的方法有很多，其中高盐提取基因组ＤＮＡ方法的优点是可以将ＤＮＡ与蛋白质、多糖充分分离，对提取含有大量次生代谢产物物种的ＤＮＡ是较为理想的方法［2］。据此，本实验选用了３种高盐方法，即高盐ＳＤＳ法［３］、高盐ＣＴＡＢ法［４］和高盐低ｐＨ值法［５］，比较３种方法的提取效果，以找到黄芪基因组ＤＮＡ的最佳提取方法，为进一步分子生物学研究奠定基础。

１材料与方法

１．１材料

本实验采用种植了两周的蒙古黄芪叶片作为研究对象，蒙古黄芪种子购于内蒙古赤峰市喀喇沁旗牛家营子镇中药材基地。

１．２仪器

水浴恒温摇床（ＺＨＷＹ－１１０Ｘ３０），台式多功能高速离心机（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８０４Ｒ），紫外分光光度计（ＮＤ－１０００Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ），凝胶成像仪（ＧｅｎＧｅｎｉｕｓ），基因扩增仪（ＢｉｏｍｅｔｒａＴ１）。

１．３无菌苗的种植

１．３．１种子预处理挑选饱满的黄芪种子，用研钵研成粉末，研磨过程中加入少许沙粒，用７５％的乙醇浸泡３０ｓ，０．１％升汞浸泡５ｍｉｎ，无菌水冲洗３次，最后用无菌水３７℃浸泡３ｈ［６］。

１．３．２培养基母液配制大量元素１０００ｍＬ，含硝酸钾１９．０ｇ、氯化铵２２．２ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ３．７ｇ、磷酸二氢钾１．７ｇ、无水ＣａＣｌ２３．３ｇ。有机成分２００ｍＬ，含肌醇２．０ｇ、盐酸硫胺（ＶＢ１）０．００２ｇ、盐酸吡哆

锌（ＶＢ６）０．０１ｇ、烟酸０．０１ｇ、甘氨酸０．０４ｇ。螯合铁２００ｍＬ，含ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１．１１ｇ、乙二胺四乙酸

二钠１．５ｇ。微量元素２００ｍＬ，含ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ

３．４ｇ、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１．７ｇ、Ｈ３ＢＯ４１．２ｇ、ＫＩ０．１７ｇ、

Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ０．０５ｇ、ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ０．００５ｇ、ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ０．００５ｇ。

１．３．３分装培养基取１００ｍＬ三角瓶，加入２０ｍＬＭＳ培养基（大量元素１００ｍＬ／Ｌ，微量元素１０ｍＬ／Ｌ，有机成分１０ｍＬ／Ｌ，螯合铁１０ｍＬ／Ｌ，蔗糖３０ｇ／Ｌ，琼脂７．０ｇ，调ｐＨ值为５．７，１２１℃，２０ｍｉｎ高压灭菌）。每个三角瓶接种５～６颗种子，人工气候箱光照和暗培育各１２ｈ交替进行，温度设置为（２０±１）℃，湿度为７０％，待发芽后，取长出的叶片作为提取ＤＮＡ的材料。

１．４黄芪基因组ＤＮＡ的提取方法

１．４．１高盐ＳＤＳ法［３］取黄芪幼苗的新鲜叶片０．２～０．４ｇ于研钵中，快速加入液氮并将其研成粉末，将粉末转入离心管中，立即加入８０ μＬ溶液Ⅰ

（５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，５０ｍｍｏｌ／ＬＴris－HＣｌ，５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ）和１６ μＬ β－巯基乙醇，置于室温数分钟至解冻；加入２７０ μＬ１０％ＳＤＳ，轻轻混匀；６５℃水浴２５ｍｉｎ；将离心管取出后立即置于冰上，并加入１２０ μＬ５ｍｏｌ／ＬＫＡｃ反应３５ｍｉｎ。１３０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心２０ｍｉｎ；取上清液，加入０．９倍体积的异丙醇，轻轻混匀后，－２０℃过夜放置。４℃，１３０００ｒ／ｍｉｎ，离心２０ｍｉｎ；弃上清液，用５００ μＬ 1×ＴＥ缓冲液溶解沉淀；向其中加等体积的氯仿－异戊醇（２４∶１，Ｖ／Ｖ，下同）溶液混匀后，４℃，８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；取上清液，向其中加入０．８倍体积的异丙醇和０．１倍体积的

３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，于－２０℃放置１ｈ后，４℃，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ；弃上清液，用１ｍＬ７０％乙醇漂洗，４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，弃上清，干燥

３ｈ；加５０ μＬ 1×ＴＥ缓冲液溶解沉淀；加４ μＬ１０ｍｇ／ｍＬＲＮａｓｅＡ混匀，并在３７℃环境下温浴３０ｍｉｎ，置于－２０℃下备用。

１．４．２高盐ＣＴＡＢ法［４］①提取缓冲液配方。ＤＮＡ提取缓冲液Ⅰ为０．３５ｍｏｌ／ＬＳｏｒｂｉｔｏｌ（山梨醇）、

１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－HＣｌ（ｐＨ值为７．５）、０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，核裂解缓冲液Ⅱ为１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－HＣｌ（ｐＨ值为７．５）、０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、２％ＣＴＡＢ，５％十二烷基肌氨酸钠Ⅲ，以上３种溶液配制后进行高压灭菌（１２１℃，１５ｍｉｎ）。使用前，在核裂解缓冲液Ⅱ中加入ＤＮＡ提取缓冲液总体积１％的ＰＶＰ，ＰＶＰ完全溶解后，将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液按１．０∶１．０∶０．４的体积比混合，用前把提取混合液预热到６０～６５℃。②提取步骤。取蒙古黄芪幼苗的新鲜叶片０．２～０．４ｇ于研钵中，快速加入液氮并将其研成粉末，将粉末转入离心管中；加入等体积预热的ＤＮＡ提取混合液（４００～６００ μＬ），立即混匀，置于６５℃恒温水浴摇床上，４０～５０ｒ／ｍｉｎ摇匀９０ｍｉｎ；冷却到室温，加入等体积的氯仿－异戊醇（２４∶ｌ），轻轻上下颠倒１０～１５ｍｉｎ，常温条件下５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；立即转移上清液到新的２ｍＬ离心管中，加入总体积２／３的预冷异丙醇，上下颠倒５ｍｉｎ，在－１０～４℃下静置３０ｍｉｎ后，常温条件下５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；轻轻倒掉上清，使异丙醇挥发干净，加入６００ μＬ７５％乙醇，在４℃漂洗过夜；然后在常温条件，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃乙醇，将ＤＮＡ风干（不可太干燥），加入５００ μＬ１×ＴＥ缓冲液，置６５℃水浴１０ｍｉｎ，常温条件下使ＤＮＡ完全溶解；加入1 μＬ１０ｍｇ／ｍＬＲＮＡ酶，３７℃温育３０ｍｉｎ；冷却到室温，加入等体积的氯仿－异戊醇（２４∶1），轻轻上下颠倒１０～１５ｍｉｎ，常温条件下５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；立即转移上清至新的２ｍＬ离心管中，加上清的２／３体积的预冷异丙醇，再加入上清的０．１倍体积的３ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ，混匀，－１０～４℃静置３０ｍｉｎ，１００００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ；轻轻倒掉上清，使异丙醇挥发干净，加入６００ μＬ７５％乙醇，４℃漂洗过夜，弃乙醇，干燥３ｈ，加５０ μＬ 1×ＴＥ缓冲液溶解ＤＮＡ；置于－２０℃备用。

１．４．３高盐低ｐＨ值法［５］取黄芪幼苗的新鲜叶片０．２～０．４ｇ于研钵中，快速加入液氮并将其研成

粉末，将粉末转入离心管中，加入３ｍＬ提取液

（１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＡｃ、ｐＨ值为４．８，５０ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸二钠、ｐＨ值为８．０，５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２％ＰＶＰ，１．４％ＳＤＳ），调节ｐＨ值至５．５，迅速混匀，６５℃水浴２０ｍｉｎ；４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃沉淀。上清液有悬浮物可再次离心除去；加入１／３体积的

５ｍｏｌ／ＬＫＡｃ，使ｐＨ值为４．８，混匀，室温静置１０ｍｉｎ；４℃，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（２５∶２４∶１，Ｖ／Ｖ／Ｖ）和氯仿：异戊醇（２４∶１）各抽提一次；取上清液中加入０．７倍体积的

－２０℃预冷的异丙醇，室温放置１．５ｈ；４℃，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；用１ｍＬ７０％乙醇洗涤两次，干燥３ｈ；加入３０ μＬ 1×ＴＥ缓冲液溶解ＤＮＡ，置于－２０℃保存备用。

２结果与分析

２．１紫外分光光度计检测

利用紫外分光光度计检测３种方法提取的蒙古黄芪叶片ＤＮＡ的纯度和浓度，检测结果见表１。提取基因组ＤＮＡ后，利用紫外分光度计检测，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值为１．８～２．０，说明提取纯度良好；如果小于１．８，说明基因组ＤＮＡ中有蛋白质残留；而大于２．０则说明基因组ＤＮＡ中有ＲＮＡ残留［７］。通过检测分析发现，利用高盐ＳＤＳ法提取蒙古黄芪基因组ＤＮＡ，浓度较大，但样品ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值大于２．０，可推断其中可能有ＲＮＡ残留；利用高盐低ｐＨ值法提取蒙古黄芪基因组ＤＮＡ，提取浓度较低，可推断提取过程中ＤＮＡ损失较大；而高盐ＣＴＡＢ法，纯度和浓度较适宜，可进行后续实验。

２．２琼脂糖凝胶电泳检测

利用１％琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ，结果见图１。通过１％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示利用高盐ＳＤＳ法提取的基因组ＤＮＡ泳动速度比高盐低ｐＨ值法和高盐ＣＴＡＢ法所提取的基因组ＤＮＡ的泳动速度略慢，推测其中可能含有其他杂质。邹喻苹等［８］提出一般ＳＤＳ法只能通过提高盐度和降低温度的方法去除和沉淀蛋白质和多糖，因此该方法会导致提取ＤＮＡ含有大量的多糖，而蒙古黄芪中含有大量的黄芪多糖（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｐｏｌｙｓａｃｈａｒｉｎ，ＡＰＳ），因此，利用这种方法提取的蒙古黄芪基因组ＤＮＡ纯度较低，可能含多糖杂质；高盐低ｐＨ值法提取的基因组ＤＮＡ有拖尾现象，说明ＤＮＡ可能有降解，不能得到完整的基因组ＤＮＡ；利用高盐ＣＴＡＢ法所提取的基因组ＤＮＡ较其他两种方法，条带清晰，适宜进行后续实验。

２．３酶切检测

利用ＰｖｕⅡ单酶切和ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切检测所提取的黄芪基因组ＤＮＡ。单酶切体系：ＤＮＡ模板１０ μＬ，ＰｖｕⅡ酶１ μＬ，１０×Ｍ Bｕｆｆｅｒ２ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ７ μＬ，总体系为２０ μＬ。双酶切体系：ＤＮＡ模板１０ μＬ，１０×Ｋ Bｕｆｆｅｒ３ μＬ，ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ各１．２ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１４．６ μＬ，总体系为３０ μＬ。比较电泳图谱，酶切产物检测结果见图２。

通过１．２％琼脂糖凝胶电泳检测，３种方法所提蒙古黄芪基因组ＤＮＡ单双酶切后泳动条带均呈弥散状态，说明提取效果较好，可进行后续实验。

２．４ＰＣＲ扩增检测

ＰＣＲ扩增检测ＤＮＡ提取质量，结果见表２。

反应体系为：引物０１、０２各１ μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ），ｄＮＴＰs（２．５ｍｍｏｌ／１．２８ｍＬ）２．５ μＬ，１０×ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ２．５ μＬ，ｒＴａｑ酶０．３ μＬ，分别取３种方法所提基因组ＤＮＡ作为模板，模板加入量随浓度而定，最后用灭菌ｄｄＨ２Ｏ补足到总体积为２０ μＬ。

反应程序为：预变性９４℃，２ｍｉｎ；变性９４℃、

３０ｓ，退火４０℃、３０ｓ，延伸７２℃、９０ｓ，３８个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ后，于４℃保存。ＰＣＲ产物经１．２％琼脂糖凝胶电泳检测结果见图３。

图３的２、３泳道分别为以高盐ＣＴＡＢ法和高鹽低ｐＨ值法提取的基因组DNA为模板，利用胆碱单加氧酶引物进行ＰＣＲ扩增的产物，其条带完整清晰，可进行后续分子实验。而以高盐ＳＤＳ法提取的基因组DNA为模板，用同样引物进行ＰＣＲ时，未扩增出条带，可能是利用此方法所提基因组ＤＮＡ中含有杂质，影响扩增结果。

综上所述，经紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、酶切、ＰＣＲ扩增检测结果显示，高盐ＣＴＡＢ法是提取蒙古黄芪基因组ＤＮＡ的最佳方法。

３讨论

获得高质量的基因组ＤＮＡ是后续分子实验的关键步骤。本实验根据蒙古黄芪富含黄芪多糖、氨基酸等成分的特点，采用高盐方法提取其基因组ＤＮＡ，比较３种高盐方法的提取效果分析如下。第一，高盐ＳＤＳ法。利用此法所提取的蒙古黄芪基因组ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳时，泳动速度比其他两种方法较慢，推断可能有其他杂质残留，高盐ＳＤＳ法去除多糖类物质效果较差，因此不适宜富含多糖的植物——蒙古黄芪的基因组ＤＮＡ的提取。第二，高盐低ｐＨ值法。Ｃａｏ［９］等人认为这种方法其中的提取介质能有效防止组织破碎及沉淀大量材料时的电离化作用以及酚化物的进一步氧化，提取的ＤＮＡ纯度较好。但是本实验证明，高盐低ｐＨ值法提取的蒙古黄芪基因组ＤＮＡ降解现象严重，不利于后续分子实验的进行，此外，这种方法提取的ＤＮＡ经紫外分光光度计检测的浓度较低，不能得到完整的基因组ＤＮＡ。第三，高盐ＣＴＡＢ法。王景雪等［１０］证明高盐ＣＴＡＢ法适于植物新鲜叶片的基因组ＤＮＡ的提取，而提取过程中ＤＮＡ形成后可溶于高盐溶液并与蛋白质和多糖形成复合物，当降低盐浓度时，ＤＮＡ可沉淀析出，从而与蛋白质和多糖分离较彻底；此外，本实验的高盐ＣＴＡＢ法比一般的ＣＴＡＢ法在提取液中多加了ＰＶＰ，ＰＶＰ可与酚类物质结合形成水不溶性的复合物，可以有效的去除酚类物质，提高ＤＮＡ提取纯度。综上所述，相比高盐ＳＤＳ法和高盐低ｐＨ值法，高盐ＣＴＡＢ法提取的蒙古黄芪基因组ＤＮＡ质量最高，适合后续分子实验的进行。

参考文献：

［１］邸瑞琦．内蒙古地区黄芪生长的农业气候条件分析［Ｊ］．内蒙古气象，２００２（２）：３４－３９．

［２］马月萍，戴思兰．高盐沉淀ＣＴＡＢ法提取温室菊花基因组ＤＮＡ［Ｊ］．生物技术通报，２００９（７）：９０－９３．

［３］杜道林，马文儒，苏杰，等．ＳＤＳ、ＣＴＡＢ和ＰＶＰ法提取香蕉基因组ＤＮＡ的比较研究［Ｊ］．海南师范学院学报（自然科学版），２００３，１６（１）：７４－８０．

［４］张美善．高粱叶片胚乳ＤＮＡ甲基化水平和模式的遗传与变异研究［Ｄ］．长春：东北师范大学，２００７．

［５］许理文，王风格，赵久然，等．高盐低ｐＨ值法提取玉米基因组ＤＮＡ的研究［Ｊ］．玉米科学，２００９，１７（１）：５９－６１，７０．

［６］刘小勇，田素忠，秦国夫，等．提取植物和微生物ＤＮＡ的ＳＤＳ－ＣＴＡＢ改进法［Ｊ］．北京林业大学学报，１９９７，１９（３）：１００－１０３．

［７］萨姆布鲁克Ｊ，拉塞尔ＤＷ．分子克隆实验指南［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．

［８］邹喻苹，汪小全，雷一丁，等．几种濒危植物及其近缘类群总ＤＮＡ的提取与鉴定［Ｊ］．植物学报，１９９４，３６（７）：５２９－５３２．

［９］ＣＡＯＨ，ＢＵＴＰＨ，ＳＨＡＷＰＣ．ＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒｏｍｐｌａｎｔｄｒｕｇｍａｔｅｒｉａｌｓ［Ｊ］．ＪＣｈｉｎＰｈａｒｍａＳｃｉ，１９９８，７：１３０－１３７．

［１０］王景雪，孙毅，高武军．一种简便实用的植物总ＤＮＡ提取方法［Ｊ］．山西大学学报（自然科学版），２０００，２３（３）：２７１－２７２．

推荐访问：蒙古 基因组 黄芪提取方法