白花蛇舌草总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究

摘要：研究白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd）总黄酮的提取工艺及其体外抗氧化活性。以白花蛇舌草总黄酮提取率为评价参数，通过单因素试验、正交试验优化提取工艺；测定了总还原力及Fe2+螯合力、羟自由基和超氧阴离子清除能力研究白花蛇舌草总黄酮的抗氧化活性。结果表明，用95%乙醇与白花蛇舌草粉末按40∶1（mL∶g），在90 ℃下提取180 min，此时提取率最高，达（2.22±0.01）%。体外抗氧化活性结果显示白花蛇舌草总黄酮具有较强的总还原力，Fe2+螯合率最高为90%，羟自由基和超氧阴离子的清除率分别达79%、77%。白花蛇舌草总黄酮具有显著的体外抗氧化活性，具有进一步开发利用的价值。

关键词：白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd）；总黄酮；正交试验；体外抗氧化

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）18-3523-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.033

Abstract： This study was to optimize the conditions of extraction of total flavonoids from Hedyotis diffusa Willd and detect their antioxidant activities in vitro. Using extraction rate as the evaluation index，single factor experiments and orthogonal test were adopted to optimze the extraction process. Then，four antioxidant parameters of total flavonoids from Hedyotis diffusa Willd，including total reducing power，Fe2+ chelating，hydroxy radical scavenging，and superoxide anion radical scavenging capacities，were measured. The results showed that the optimum conditions of extraction were as following：ethanol concentration was 95%，the ratio of liquid to solid was 40∶1（mL∶g）； extraction time 180 min and temperature，90 ℃. Under these conditions，the extrction ratio was（2.22±0.01）%. The total flavonoids from Hedyotis diffusa Willd had showed high total reducing power，their chelating rate of Fe2+ reached 90%，the radical scavenging activities against hydroxyl radical and superoxide anion were 79% and 77%，respectively. So the antioxidant activities in vitro of flavonoids from Hedyotis diffusa Willd is obvious，which is worth further being developed and utilized.

Key words： Hedyotis diffusa Willd； total flavonoids； orthogonal test； antioxidant activities

白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd）属于茜草科耳草属，全草含三萜类、环烯醚萜、蒽酮类、黄酮类化合物、有机酸及酯类等化合物[1，2]，具有抗肿瘤、抗炎、提高免疫力、抗氧化、抗化学诱变、保护胃黏膜损伤等作用[3-12]。

黄酮类化合物是大多数植物的次生代谢产物，分布广泛，是一种新发现的营养元素，对人体具有重要的生理保健功效[13，14]。黄酮类化合物具有多种生理活性且对人体的不良反应较少，是一种对人类健康有促进作用的化合物。临床上常用于治疗心血管疾病、糖尿病、肿瘤等[15-20]。目前，关于如何高效获得白花蛇舌草总黄酮及其抗氧化作用的报道较少。本试验就乙醇浸提法研究白花蛇舌草总黄酮提取工艺，以4个指标评价其抗氧化活性，为白花蛇舌草活性成分的进一步开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白花蛇舌草购于来凤县地产中药材综合开发有限责任公司，经60 ℃烘干粉碎，过60目筛；抗坏血酸、EDTA-Na2、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、焦性没食子酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、水杨酸等试剂购自天津市光复科技发展有限公司；亚硝酸钠、氢氧化钠片、无水乙醇、硝酸铝、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁等试剂购自天津市福晨化学试剂厂；菲咯嗪购自日本东京化成工业株式会社，以上药品均为分析纯。芦丁标准品购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GZX-9140 MBE型数显鼓风干燥箱、HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司），ITDL80-2B型台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造），TU-1810型紫外分光光度计（北京普析通用儀器有限责任公司），BC-R501C型旋转蒸发器（上海贝凯生物化工设备有限责任公司）。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮含量测定 参照2015版《中华人民共和国药典》[21]采用NaNO2-Al（NO3）3法建立标准曲线。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度c（μg/mL）为横坐标，绘出芦丁标准曲线图，并得回归方程：y=9.809 6x+0.000 9，R2=0.999 2。按如下公式计算总黄酮含量：

总黄酮含量=■×100%

式中，c为样品溶液质量浓度（μg/mL）、A为稀释倍数、V为提取液体积（mL）、m为白花蛇舌草质量（mg）。

1.3.2 单因素试验

1）液固比对总黄酮提取率的影响。称取适量的白花蛇舌草粉末，分别按液固比10∶1、20∶1、30∶1、 40∶1、50∶1（mL∶g，下同）加入70%乙醇于80 ℃水浴120 min，然后将提取液于3 500 r/min離心15 min，测定上清液中总黄酮含量。

2）提取时间对总黄酮提取率的影响。称取适量白花蛇舌草粉末，按液固比20∶1加入70%乙醇于80 ℃水浴锅中水浴，水浴时间分别为30、60、90、120、150、180 min。3 500 r/min离心15 min，测定上清液中总黄酮含量。

3）提取温度对总黄酮提取率的影响。称取适量白花蛇舌草粉末，按液固比20∶1加入70%乙醇分别于50、60、70、80、90 ℃水浴120 min。相同条件下将提取液离心后测定上清液中总黄酮含量。

4）乙醇浓度对总黄酮提取率的影响。称取适量的白花蛇舌草粉末，按液固比20∶1分别加入60%、70%、80%、90%、95%的乙醇于80 ℃水浴120 min，然后提取液离心，测定上清液中总黄酮含量。

1.3.3 正交试验 综合单因素试验结果，设计了4因素3水平正交试验L9（34），因素与水平设计见表1。

1.4 白花蛇舌草总黄酮抗氧化活性测定

1.4.1 总还原力的测定 总还原力的测定参照Oyaizu等[22]的方法。以抗坏血酸为阳性对照，比较相同浓度下白花蛇舌草总黄酮和抗坏血酸还原力的强弱。吸光度越大，表示总还原力越强。

1.4.2 铁离子螯合力的测定 Fe2+螯合力的测定参照Fan等[23]的研究方法。以EDTA-Na2为对照，比较浓度为0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL时白花蛇舌草总黄酮和EDTA-Na2螯合金属离子能力的强弱，所有试验均重复3次。铁离子螯合率=[1-（A1-A2）/A0]×100%，其中，A0、A1、A2分别为不加样品溶液体系，加样品和菲咯嗪溶液体系，加样品和不加菲咯嗪溶液体系的吸光度。

1.4.3 羟自由基清除力的测定 通过水杨酸钠法[24]测定羟自由基清除力。以抗坏血酸为阳性对照，设置不加水杨酸钠的体系为阴性对照，测定反应液在510 nm的吸光度，并将结果用羟自由基清除能力表示，所有试验均重复3次。羟自由基清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%，式中，A0、A1、A2分别为不加样品溶液体系，加样品和水杨酸钠溶液体系，阴性对照的吸光度。

1.4.4 超氧阴离子清除力的测定 采用邻苯三酚自氧化法[25]，以抗坏血酸作为阳性标准品，利用浓盐酸终止反应，比较白花蛇舌草总黄酮和抗坏血酸抑制超氧阴离子生成的能力，结果用超氧阴离子清除率表示，所有试验均重复3次。超氧阴离子清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%，其中，A0、A1、A2分别为不加样品溶液体系，加样品和邻苯三酚溶液体系，加样品和稀盐酸体系的吸光度。

1.5 数据处理

用Origin 8.0进行单因素和体外抗氧化数据分析，数据以平均数±标准差（Standard deviation，SD）表示，组间多重比较采用Tukey法；正交试验及数据分析采用SPSS 16.0软件。

2 结果与分析

2.1 白花蛇舌草总黄酮干物质组分分析

白花蛇舌草浸膏真空干燥后为即为其总黄酮粗品，粗品总黄酮含量可达96.2%，为粗品的主要成分。因此，总黄酮为白花蛇舌草体外抗氧化的物质基础。

2.2 白花蛇舌草总黄酮提取工艺优化

2.2.1 单因素试验结果 液固比对白花蛇舌草总黄酮提取率有一定的影响，在一定范围内，增大液固比能提高白花蛇舌草总黄酮的提取率，当液固比达到40∶1时，总黄酮提取率不再显著提高（图1A）。图1B显示，提取时间较短时白花蛇舌草总黄酮提取率呈增加状态，但变化并不显著，当水浴时间达到150 min时提取率显著上升，随后有下降趋势。高温能促进白花蛇舌草总黄酮的溶出。从图1C可以看出，在适当的温度范围内升高温度总黄酮提取率显著提高，超过该温度后提取率变化不明显。图1D表明乙醇浓度升高能促进白花蛇舌草总黄酮溶出，且作用显著，在乙醇浓度达到90%后作用效能减弱。因此，以液固比30∶1、40∶1、50∶1，水浴时间120、150、180 min，水浴温度70、80、90 ℃，乙醇浓度80%、90%、95%为正交试验的3个水平。

2.2.2 乙醇浸提白花蛇舌草总黄酮的结果 正交试验结果如表2所示。由表2可以看出，最优工艺为A2B3C3D3，即用95%的乙醇以40∶1的液固比在90 ℃下提取180 min。表3为正交试验方差分析，浸提温度和溶剂浓度对产物溶出率的影响，均为显著（P<0.05），而提取溶剂加入的比例和浸提时间对总黄酮的溶出作用并不明显。比较F值可知，试验因素的主次顺序与极差分析一致。对正交试验结果进行验证，总黄酮的提取率可达（2.22±0.01）%。

2.3 白花蛇舌草总黄酮体外抗氧化活性

2.3.1 总还原力测定 白花蛇舌草总黄酮的总还原力在一定浓度范围内逐渐增大，当达到一定浓度后，总还原力达到最大，不再上升。比较VC和白花蛇舌草总黄酮的总还原力发现，在相同浓度下的作用效果，低浓度时白花蛇舌草总黄酮的总还原力较VC弱，随着溶液浓度的升高，白花蛇舌草总黄酮的总还原力上升幅度大于VC，并超过VC的总还原力，二者浓度在1.0 mg/mL时达到最大（图2）。

2.3.2 铁离子螯合力的测定 白花蛇舌草总黄酮具有较强的铁离子螯合力。由图3可以得知，EDTA-Na2和白花蛇舌草总黄酮对铁离子螯合率均具有剂量依赖性。低浓度时，铁离子螯合率随着浓度增大而增幅较快，其后随着溶液浓度的增大，螯合率的变化逐渐减小直至极值。低浓度的白花蛇舌草总黄酮对铁离子的螯合能力大于相同浓度EDTA-Na2的螯合能力；当浓度超过1.0 mg/mL后，EDTA-Na2的螯合能力略大于白花蛇舌草总黄酮的铁离子螯合力。

2.3.3 羟自由基清除力的测定 白花蛇舌草总黄酮对羟自由基有明显的清除作用，但该作用较同浓度VC弱。VC和白花蛇舌草总黄酮对羟自由基的清除效率随浓度的升高作用越来越大，直至浓度达到2.0 mg/mL时VC对该自由基的清除作用达到最大，为99%，此时白花蛇舌草总黄酮的清除效率为80%；当白花蛇舌草总黄酮的浓度大于1.0 mg/mL时其对羟自由基的清除能力变化不再明显，相同浓度相同条件下VC对羟自由基的清率始终大于白花蛇舌草总黄酮（图4）。

2.3.4 超氧陰离子清除力的测定 白花蛇舌草总黄酮具有较强的清除超氧阴离子的作用，白花蛇舌草黄总酮的超氧阴离子清除能力在一定浓度范围内呈剂量依赖性。比较VC与白花蛇舌草黄总酮二者的超氧阴离子清除能力，发现高浓度的VC对超氧阴离子的清除率接近100%，而白花蛇舌草总黄酮对超氧阴离子的清除率在达到70%后不再增大（图5）。

3 结论

本试验研究了影响溶液浸提法的4个因素——液固比、提取时间、提取温度及乙醇浓度对白花蛇舌草总黄酮溶出率的影响。结果表明，用95%乙醇与白花蛇舌草粉末按40∶1，在90 ℃下提取180 min，总黄酮提取率可达（2.22±0.01）%。白花蛇舌草总黄酮具有较强的总还原力和Fe2+螯合力，对羟自由基和超氧阴离子自由基有较强的清除能力。白花蛇舌草总黄酮潜在的抗氧化活性有望使其开发为新的抗氧剂。

参考文献：

[1] 张 轲.白花蛇舌草化学成分研究[D].北京：中国中医科学院，2016.

[2] 马 河，李方丽，王 芳，等.白花蛇舌草化学成分研究[J].中药材，2016，39（1）：98-102.

[3] 李方丽.白花蛇舌草化学成分及其体外抗肿瘤活性研究[D].济南：山东中医药大学，2016.

[4] 纪宝玉，范崇庆，裴莉昕，等.白花蛇舌草的化学成分及药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（19）：235-240.

[5] 毛 宇，徐 芳，徐小娟，等.白花蛇舌草抗肿瘤成分及其作用机理研究进展[J].现代预防医学，2015，42（17）：3128-3132.

[6] 李文婷，戴紫函，程海波，等.白花蛇舌草活性成分及其协同抗肿瘤机制研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化，2015，17（3）：670-674.

[7] 肖 云，伍治平，金从国，等.白花蛇舌草提取物抗小鼠结直肠癌血管生成的实验研究[J].昆明医科大学学报，2013（10）：53-57.

[8] 文雪梅，陈 瑛，李 婷，等.白花蛇舌草对宫颈癌细胞增殖、凋亡及Ki-67表达的影响[J].中国老年学杂志，2017，37（3）：561-563.

[9] 吴逢选，周郁鸿，叶宝东.白花蛇舌草抗肿瘤机制研究进展及其在血液病中的应用[J].中华中医药杂志，2015（1）：167-169.

[10] 杨真真，姜梦丽，赖宏强，等.白花蛇舌草抗炎作用及优选组分处方[J].福建中医药大学学报，2014，24（3）：49-51.

[11] 王洪鸽，汤 承，王 航，等.白花蛇舌草多糖对小鼠免疫功能和生长发育的影响[J].中国畜牧兽医，2013，40（10）：140-143.

[12] 朴红梅，宋秋红，金延燕，等.白花蛇舌草对哮喘模型小鼠Th1/Th2免疫平衡的影响[J].中国医院药学杂志，2013，33（17）：1381-1385.

[13] 刘星雨，周 敏，孙体健.天然黄酮类化合物的药理活性及分离提取[J].中国药物与临床，2014，14（5）：621-624.

[14] 胡云霞，樊金玲，武 涛.黄酮类化合物分类和生物活性机理[J].枣庄学院学报，2014，31（2）：72-78.

[15] 张怀民，杨 虹，郑海洲.天然黄酮类化合物防治心脑血管疾病的研究进展[J].中国新药与临床杂志，2016（10）：704-708.

[16] 李湘洲，栾芳菲，张 胜，等.黄酮类化合物的抗肿瘤和抗血管生成作用研究进展[J].食品与机械，2016（1）：199-201，206.

[17] 孙晓润，陈苹苹，林 悦，等.天然黄酮类化合物抗肿瘤作用靶点研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（6）：218-228.

[18] 李 丹，彭 成，谢晓芳.黄酮类化合物治疗糖尿病及其并发症的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（11）：239-242.

[19] 董丽红，张瑞芬，苏东晓，等.食源性黄酮类化合物改善脂质代谢作用及其机制研究进展[J].中国细胞生物学学报，2016， 38（1）：81-90.

[20] 徐学君，张秀芳，徐德琴，等.黄酮类化合物调节血脂作用的研究进展[J].中国药房，2016，27（1）：114-117.

[21] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015版）一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[22] OYAIZU，M. Studies on products of browning reaction-antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine[J].The Janpanese Journal of nutrition，1986， 44：307-315.

[23] FAN L P，LI J W，DENG K Q，et al. Effects of drying methods on the antioxidant activities of polysaccharides extracted from Ganoderma lucidum[J].Carbohydrate Polymers，2012，87：1849-1854.

[24] 邰 超，邹 洪，谷学新，等.Fenton反应产生的羟自由基及其清除的电化学方法测定[J].分析测试学报，2002，21（5）：30-32.

[25] SUN C，WANG J W，FANG L. Free radical scavenging and antioxidant activities of EPS2，an exopolysaccharide produced by a marine filamentous fungus Keissleriella sp.YS 4108[J].Life Sciences，2004，75：1063-1073.