冬虫夏草PCR快速检测试剂盒的研制与效果评价

材料与方法

11样品

本文所用样品均经成都中医药大学国锦琳教授鉴定，凭证样品保存于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室，样本信息见表1。

12试剂盒的组成

冬虫夏草PCR快速鉴定试剂盒规格为50次/盒，试剂组成见表2，其中Primer premix为1对冬虫夏草特异引物（SIF6： 5′TTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATT3′，SIR6：5′GCTTGCTTCTTGACTGAGAGGTGCC3′），根据其rDNA ITS序列的特异性位点设计而来，扩增片段大小为174 bp。以冬虫夏草基因组DNA为阳性对照，无菌ddH2O为阴性对照。

13试剂盒的使用

试剂盒使用方法如下：①改良碱裂解法快速提取虫草基因组DNA。在约10 mg虫草子座粉末中加入80 μL Buffer A，混匀，再加入160 μL Buffer B混匀后，静置5 min，取上清液即得虫草基因组DNA。②PCR扩增：扩增体系为25 μL /PCR，包含125 μL 2×Taq PCR master mix，2 μL Primer premix，待检样品或阳、阴性对照品 1 μL，补充ddH2O至25 μL；扩增程序为94 ℃预变性1 min，然后进行30个循环，条件为94 ℃变性30 s，67 ℃退火并延伸30 s。③荧光检测：在扩增产物中加入2 μL 100×SYBR Green Ⅰ混匀后，置紫外灯下观察是否显示绿色荧光，若显示，则为冬虫夏草，反之，则为伪品。

侯飞侠等：冬虫夏草PCR快速检测试剂盒的研制与效果评价14试剂盒的性能检测

参考2015年版《中国药典》三部生物诊断试剂盒的要求[14]，对试剂盒的特异性、检测限、重复性和保存期等性能进行了考察。

141特异性以表1所列虫草的基因组DNA为模板，用本研究开发的试剂盒进行特异性检测。

142检测限分别将质量为5，125，25，50，100，200，400，5 000 μg的冬虫夏草子座粉末混匀于蛹虫草子座粉末中，使混合粉末的质量为5 mg，再分别用试剂盒进行检测。

143重复性随机取同批次组装的试剂盒3盒，分别在不同操作条件（不同操作时间、人员、地点、人员以及不同型号的PCR仪）下对阳性对照和阴性对照进行检测，考察批内重复性，见表3。

随机选取3盒不同批次的试剂盒，在相同的试验条件下对阳性对照和阴性对照进行检测，考察批间重复性。

144保存期参考生物诊断试剂盒保存期加速破坏试验，37 ℃保存3 d后仍有活性，表明该试剂盒可在4～8 ℃保存6个月，37 ℃保存7 d后仍有活性，表明该试剂盒可在4～8 ℃稳定保存1年。本研究将试剂盒分别置于37 ℃ 3 d和7 d后取出对阳性对照和阴性对照进行检测，考察试剂盒的保存期。

15应用

使用该试剂盒，分别对成都荷花池中药材专业市场销售的冬虫夏草12份，伪品及金针虫虫草Cordyceps agriota各6份进行检测。

2结果

21试剂盒的特异性及检测限

利用该试剂盒对表1所列的冬虫夏草、凉山虫草、蛹虫草、古尼虫草及蝉花进行检测。仅有冬虫夏草可扩增出174 bp的目的条带。在扩增产物中加入核酸染料SYBR Green I后，仅有冬虫夏草显示绿色荧光，结果见图1。

冬虫夏草和蛹虫草不同比例混合的5 mg粉末采用本试剂盒进行检测，结果发现，含有25 μg及以上质量的冬虫夏草可显示绿色荧光，即冬虫夏草与混合物的比例为1∶200以上时可被成功检测，见图2。

22试剂盒的重复性

从2015年12月19日组装的试剂盒中随机选取3盒，在不同操作条件（不同操作时间、地点、人员、仪器）下分别对阳性对照和阴性对照进行测试。结果表明，阳性对照在紫外下均显示绿色荧光，阴性对照均无，说明试剂盒具有良好的批内重复性，见图3。在相同的操作条件下，利用3盒不同批次的试剂盒分别对阳性和阴性对照进行检验，结果显示，陽性对照均显示绿色荧光，阴性对照则不显示，说明试剂盒批间重复性良好，见图4。

23试剂盒的保存期

试剂盒中NaOH和TrisHCl在常温下性质稳定，而引物、含有DNA Taq酶和dNTP的2×Taq PCR master mix需在-20 ℃冻存以保持活性。试剂盒的保质期表现了试剂盒在未经使用时本身的稳定性，本研究参考药典规定的生物制剂试剂盒的保存期加速破坏试验，测试结果见图5，37 ℃温育3 d，阳性对照仍可被有效扩增，37 ℃温育7 d，阳性对照仍能被有效扩增。保存期考察表明，试剂盒4 ℃保存在1年内稳定有效。

24试剂盒的实践应用

采用本研究研制的试剂盒分别对市售的12份冬虫夏草，6份伪品虫草和6份金针虫虫草进行检测。结果见图6。 12份冬虫夏草的试剂盒检测均为阳性，而12份非冬虫夏草的试剂盒检测为阴性，说明该试剂盒可用于检测市售冬虫夏草的真伪。

3讨论

冬虫夏草产于青藏高原海拔3 000 m以上的高山草甸及灌木丛下，近年来由于全球变暖导致雪线上移，寄主昆虫蝙蝠蛾大量死亡，加之过度采挖，野生资源下降明显，目前尚无规模化的人工培育技术，但市场需求巨大，供需矛盾日益显著。全世界冬虫夏草的近缘物种有近300种，部分形态与冬虫夏草相似度极高，常规形态鉴别方法难以区分，粉末、饮片等加工品更是难以鉴别，导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象频发[15]，严重影响临床用药安全和人民健康。现鉴定方法大多对实验环境、操作人员经验要求高，操作复杂，多需大型仪器，推广应用有一定的难度。而物种特异性PCR（speciesspecific PCR，SSPCR）扩增技术，通过设计高特异性的引物，序列经PCR扩增后，通过检测靶标片段的有无，从而实现鉴别物种的目的。该技术特异性强，同时通过电泳图谱实现定性鉴别，省去测序分析等，降低成本，节约时间。目前已运用SSPCR方法成功鉴别了白花蛇舌草[16]、金银花[17]、蕲蛇[18]、乌梢蛇[19]、人参[20]、黄芪[21]等中药材。本研究在冬虫夏草的SSPCR技术基础上，开发出了其快速检测试剂盒。本试剂盒首先采用改良的碱裂解法提取虫草基因组DNA，提取过程中无需离心，摆脱了其对离心机的依赖性。同时本试剂盒利用SSPCR技术对冬虫夏草进行鉴定，采用SYBR Green I 荧光检视代替琼脂糖凝胶电泳，无需使用电泳仪及凝胶成像系统等大型仪器，节约了时间，使冬虫夏草的现场检测成为可能。本研究证实了该试剂盒的特异性、重复性和稳定性良好，对市售冬虫夏草的真伪鉴定结果准确可靠，为下一步中药快检试剂盒的商品化奠定了基础。

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