列当中苯乙醇苷类成分的含量测定

材料

1.1 仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪（DAD检测器，四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器，chromeleon色谱工作站，Thermo Fisher）；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）；AL240分析天平（梅特勒-托利多仪器厂）；KQ-500DE超声仪（昆山市超声仪器厂）。

1.2 试剂

毛蕊花糖苷和crenatoside为实验室自制，经MS，H1-和C13-NMR确定结构，HPLC峰面积归一化法测得纯度均大于98%，乙腈（美国Fisher公司，色谱纯），水为娃哈哈纯净水，其他均为分析纯。

1.3 药材

列当药材为内蒙古各地采集，经内蒙古医科大学王素巍讲师鉴定为列当O. coerulescens的全草。

2 方法与结果

2.1 HPLC测定毛蕊花糖苷和crenatoside的含量

2.1.1 色谱条件 Inertsil ODS-RP HPLC色谱柱（4.6 mm ×250 mm， 5 μm）；流动相为乙腈-0.l%磷酸水溶液（22∶78）；检测波长为330 nm；柱温30 ℃；流速1 mL·min^-1，进样量10 μL，色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液制备 取减压干燥至恒重的对照品适量，分别精密称定，加入甲醇溶解制成每1 mL含毛蕊花糖苷0.52 mg，crenatoside 0.53 mg的对照品溶液A、B，精密吸取A、B对照品溶液各1.0 mL，置5 mL量瓶中，甲醇定容，制备成混合对照品溶液C。保存于4 ℃的冰箱，备用。

2.1.3 供试品溶液制备 列当粉末（过40目筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，称定质量，浸泡1 h后，超声（功率500 W，频率40 kHz）提取30 min，冷却后补足失重，摇匀，静置，滤过，取续滤液即得。

2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品C溶液1，2，5，10，20，30 μL以及单一对照品A溶液10，12，16 μL注入液相色谱仪，测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明毛蕊花糖苷在0.104～8.320 μg线性关系良好， 回归方程为Y=20.056X-0.483，r=0.999 9；crenatoside 在0.106～3.180 μg线性关系良好，回归方程为Y=20.182 X+0.025，r=1.000 0。

2.1.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液，连续进样6次，记录色谱峰面积。结果毛蕊花糖苷，crenatoside峰面积的RSD分别是0.23%，0.39%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一份供试样品粉末6份，精密称定，按2.1.3项下方法平行制备供试品溶液，连续进样，记录色谱峰面积。 结果毛蕊花糖苷、crenatoside峰面积的RSD分别为1.0%，1.3%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，分别在样品制备后的0，2，4，6，8 h内进样5次，记录色谱峰面积。结果毛蕊花糖苷、crenatoside峰面积的RSD分别为0.28%，0.69%。表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取已知含量的列当样品（表3，12号）粉末（毛蕊花糖苷99.2 mg·g^-1，crenatoside 29.7 mg·g^-1） 9份，每份约0.05 g，精密称定，分别按该样品中待测成分含量的80%，100%，120%，精密加入2个对照品适量，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，进样测定并计算各成分平均加样回收率及RSD，见表1。

2.1.9 样品含量测定 按2.1.3项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积并计算2种成分的含量，见表2。

2.2 紫外分光光度法测定总苯乙醇苷的含量

2.2.1 毛蕊花糖苷对照品溶液制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品10.7 mg，用70%甲醇溶解并定容于50 mL量瓶中，得到0.214 g·L^-1的标准溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取列当粉末约0.1 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称重，室温浸泡1 h，超声提取40 min，补足失重，过滤，精密吸取滤液0.5 mL，置于25 mL量瓶中，用70%甲醇定容，即得。

2.2.3 最大吸收波长选择 分别吸取适量对照品溶液和供试品溶液于25 mL量瓶中，用70%甲醇定容，以70%甲醇为空白对照，于200～500 nm波长范围内扫描，在332 nm处得到最大吸收波长，选择332 nm为测定波长，见图2。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取毛蕊花糖苷标准溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL置于25 mL量瓶中，并用70%甲醇定容，以70%甲醇为空白对照，在332 nm处测定吸光度A。结果表明毛蕊花糖苷对照品在4.28～25.68 μg·mL-1内线性关系良好，回归方程为Y =0.033 1X + 0.000 1，r=0.999 8。

2.2.5 重复性试验 精密称取6份列当粉末各约0.1 g，按2.2.2项下方法平行制备供试品溶液6份，测定总苯乙醇苷含量，RSD为2.2%，说明本方法重复性良好。

2.2.6 精密度试验 取同一供试品溶液，连续6次测定其在332 nm处吸光度，计算得RSD 0.21%，结果表明该方法精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，12 h在332 nm处进行紫外测定，RSD为1.1%。表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的列当样品（表3，12号）粉末9份（n=3），各约0.05 g，精密称定，分别按已知总苯乙醇苷含量的 80%，100%，120% 3个水平加入毛蕊花糖苷对照品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，在332 nm处测定吸光度，计算平均回收率和RSD，见表3。

2.2.9 总苯乙醇苷含量测定 按2.2.2项下制备供试品溶液，以70%甲醇为空白对照，在332 nm处测定吸光度，并采用标准曲线法计算含量，结果见表2。

3 结论

列当中的主要成分是苯乙醇苷类成分，包括毛蕊花糖苷、crenatoside、异毛蕊花糖苷、和campneoside Ⅱ等，其中含量最高的2个成分是毛蕊花糖苷和crenatoside。

通过对15个批次不同采集地点以及不同采收时间的列当中苯乙醇苷成分的含量测定结果表明，毛蕊花糖苷、crenatoside和总苯乙醇苷的含量差异较大。毛蕊花糖苷的质量分数在1.15%～15.60% （样品10含量低于线性范围），crenatoside在0.83%～4.47%，总苯乙醇苷在6.78%～27.43%。研究中发现内蒙古东、中、西部不同地区产的药材的含量变化不是很明显。影响药材中苯乙醇苷成分含量的主要因素是采集时间。传统认为，列当药材应在6月份盛花期采集，质量好，研究亦证实了这一点，有的药材采集于盛花期，其总苷和毛蕊花糖苷含量极高，超出线性检测范围。样品（2，6，7，10，14， 15）采集时几乎在8月份，地上部分已全部枯萎，药材颜色发黑，其苯乙醇苷类成分含量较低。

4 讨论

本研究建立了HPLC同时测定列当中毛蕊花糖苷和crenatoside的方法，方法简便、准确且重复性好，为系统评价列当的质量提供科学依据。在方法建立过程中，对成分的检测波长，色谱流动相条件、流速、柱温以及苯乙醇苷类成分的提取条件都做了考察，确定流动相为乙腈-0.l%磷酸水溶液（22∶78）；检测波长为330 nm；柱温30 ℃；流速1 mL·min^-1；进样量10 μL，在这个色谱条件下，毛蕊花糖苷、crenatoside能达到很好的基线分离；且进样量分别在0.104～8.32 μg （r=0.999 9），0.106～3.18 μg （r=1.000 0）与峰面积呈良好线性关系；平均加样回收率（n=3）分别为101.9%和96.78%；精密度和重复性试验的RSD（n=6）均小于3%。提取条件最终确定为称取0.1 g药材，加70%甲醇浸泡1 h超声30 min，能使待测成分最大限度的检出。本方法操作简便，精密度、重现性良好，结果准确可靠，可用于列当药材的质量控制以及资源利用研究。

分光光度法是测定中药和天然药物中一类成分总含量的常见方法。本研究建立了紫外分光光度法测定列当总苯乙醇苷含量的方法。研究选定药材中含量极高的毛蕊花糖苷作为对照品，对照品溶液和样品溶液经全波长扫描，均在332 nm处有最大吸收。对照品毛蕊花糖苷化合物在4.28～25.68 mg·L^-1具有良好的线性关系（r=0.999 8）。该法具有操作简便快捷、设备要求低、稳定性和重现性好等优点。

研究发现，苯乙醇苷类化合物集中存在于唇形目（唇形科、马鞭草科）和玄参目（玄参科、列当科、苦苣苔科、爵床科、车前科、紫葳科），表现出该类成分与分类系统密切相关。该植物类群中许多著名的传统中药如清热解毒药（地黄、玄参、连翘），补虚药（肉苁蓉、女贞）都含有这类成分。同时，这类化合物结构相似，生物活性很强，具有良好的医疗价值。列当中苯乙醇苷含量很高，尤其是毛蕊花糖苷的含量，此研究结果为评价和利用列当资源提供了重要科学依据。

[参考文献]

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志.第69卷[M]. 北京： 科学出版社， 1999：109.

[2] 马毓泉. 内蒙古植物志.第4卷[M]. 呼和浩特： 内蒙古人民出版社， 1993：347.

[3] 国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草.第20卷.[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 1999：6557.

[4] 中国药材公司. 中国中药资源志要[M]. 北京： 科学出版社， 1994：1194.

[5] Murayama T， Yanagisawa Y， Kasahara A， et al. A novel phenylethanoid isocrenatoside isolated from the whole plant of Orobanche caerulescens[J]. Nat Med， 1998， 52（5）：455.

[6] Lin L C， Chiou W F， Chou C J. Phenylpropanoid glycosides from Orobanche caerulescens[J]. Planta Med， 2004， 70（1）：50.

[7] 赵军， 闫明， 黄毅， 等. 紫花列当水溶性成分研究[J]. 天然产物研究与开发， 2009， 21（4）：619.

[8] 张雷红，堵年生. 肉苁蓉化学成分的研究概况[J].中成药，2003，25（4）：323.

[9] 宋志宏，屠鹏飞，赵玉英， 等.管花肉苁蓉的苯乙醇苷类成分[J].中草药，2000，31（11）：808.

[10] Pan Y N， Morikawa T，Ninomiya K，et a1. Bioactive constituents from Chinese natural medicines. ⅩⅩⅩⅥ. Four new acylated phenylethanoid oligoglycosides， kankanosides J1， J2， K1， and K2， from stems of Cistanche tubulosa[J].Chem Pharm Bull，2010，58 （4）：575.

[11] 靖会， 佐建锋， 李教社.苯乙醇苷类化合物的药理研究进展[J].时珍国医国药，2006，17（3）：440.

[12] Afifi M S， Lahloub M F， Elkhayaat S A， et al. Crenatoside： a novel phenylpropanoide glycoside from orobanche crenata[J]. Planta Med， 1993， 59（4）：359.

[13] 林娟， 高莉， 霍仕霞， 等. 类叶升麻苷对东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍的改善作用[J].中国中药杂志， 2012， 37（19）：2956.

[14] 陈微娜， 李飞， 朱盼盼， 等. 毛蕊花糖苷对新生大鼠体外培养成骨细胞增殖与分化作用研究[J]. 海峡药学， 2012， 24（4）：23.

[15] 王琳琳， 李薇， 宋新波， 等. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的植物雌激素活性研究[J]. 天然产物研究与开发， 2014， 26（3）：377.

[16] 高莉， 彭晓明， 霍仕霞， 等. 毛蕊花糖苷改善D-半乳糖致亚急性衰老小鼠脑损伤的作用[J]. 中草药， 2014， 45（1）：81.

[17] 朴景华， 蒲小平， 马建， 等. 类叶升麻苷对东莨菪碱所致记忆获得性障碍的改善作用[J]. 中国药理学通报， 2001， 17（6）： 625.

[18] Schapozal E E， Vargas M R， Chaves C G， et al. Antiinflammatory and antinociceptive activities of extracts and isolated compounds from Stachytarpheta cayennensis[J]. J Ethnopharmacol， 1998， 60（1）：53.

[19] 李教社， 赵玉英， 崔景荣. 密蒙花中苯乙醇甙的分离和鉴定[J]. 中国中药杂志， 1997， 22（10）：613.

[20] 曲正义. 向日葵列当化学成分及其抗氧化活性研究[D]. 北京： 中国农业科学院， 2010.

[责任编辑 丁广治]