高效纳豆激酶片的制备

【摘要】目的：探讨纳豆的最佳制备方法及高效纳豆激酶片的制备过程。方法：通过分离和筛选，选择出枯草芽孢杆菌纳豆亚种为菌种，并确定其活性的检测方法，然后将最佳条件下发酵的纳豆经调味、制粉压片后制成纳豆激酶片。结果：将大豆煮熟，接入纳豆菌后发酵，发酵后的纳豆经冷冻、升华干燥后粉碎，然后用葡萄糖、食盐、卡拉胶等调味，压制成片。结论：经以上处理后的纳豆激酶片，既最大地保留了其活性，又掩盖了其原有的臭味，口味易于接受，有较好的可操作性和良好的发展前景。

【关键词】纳豆激酶；发酵；枯草芽孢杆菌纳豆亚种

【中图分类号】R943【文献标识码】A 【文章编号】1674-0742(2012)03(a)-0000-00

针对目前高效纳豆激酶片的制备的制备现状，本研究利用从日本纳豆中分离到的高活性纳豆激酶（酶活力580IU/g）菌种，确定纳豆激酶固体发酵的最佳工艺后，采用冷冻升华干燥技术，粉碎后设计产品的配方，最后压制成片。这种功能性产品，适应大多数人的口味，能够长期保存，并能够预防脑血栓及心梗塞病的发生。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

纳豆杆菌；优质大豆；琼脂；葡萄糖；牛肉浸膏；酵母浸膏；蛋白胨；NaCl；NaOH；HCl；甘油；麦芽糖；木糖；蔗糖；谷氨酸钠；玉米淀粉；半乳糖。

1.2 实验方法

（1）菌种的分离和筛选：①在超净工作台中用酒精棉擦拭日本产纳豆胶囊表面，对其进行灭菌。将胶囊掰开，用接种环挑取一环胶囊内含物，加入到4.5ml无菌水中充分摇匀，此菌液编号0。②取8支试管，分别标号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8。向每支试管中加无菌水4.5ml。取9个培养皿，分为3组，每组标号10-3, 10-5, 10-7。用移液枪吸取0.5ml 0号试管中菌液打到1号试管中，充分混匀，此为10-1稀释液。以此类推制成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8几种浓度的菌液。用移液枪分别由3，5，7 号试管中吸取0.2ml菌液放入对应的培养皿中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10min。将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h。该菌株在平板上形态均近似圆型，直径2 mm～5 mm，乳白色或灰白色，不透明，菌落表面褶皱粗糙，边缘不整齐，中间皱起，用接种针挑菌落有拉丝现象。生理生化特性的测定参照《伯杰氏细菌鉴定手册6》，最终确定为枯草芽孢杆菌纳豆亚种。（2）纳豆激酶活性的测定方法：①纤维蛋白平板法：纳豆激酶活性测定通常采用纤维蛋白法，具体操作方法如下。纳豆中加入200 mL生理盐水浸提1 h，然后3000r/min离心1Omin，取上清液稀释一定的倍数，取稀释的粗酶样品5 L加在纤维蛋白平板上，37℃ 孵育18 h，量溶解圈的垂直直径，计算溶解圈面积，从标准曲线上求出样品的酶活力 J。②紫外分光光度法：具体测量方法为，向冷却后的纳豆中加入大豆干重6倍的生理盐水，充分搅拌后静置2h。取1ml上清液加入到19ml生理盐水中，混合均匀。然后迅速对粗酶液在室温下以3000r/min离心10min。离心后取上清液，即纳豆激酶粗酶提取液，测其280nm处吸光度（OD值）。③标准溶液的配备：取试管一支，编号1，在其中加入15ml生理盐水，并加入0.1g标准药品，从分溶解。领取一试管，编号2，在其中加入19ml生理盐水。用移液枪从1号试管中移取1ml溶液加入到2号试管中，混匀，即制成标准溶液。

2 结果

2.1 高活性纳豆菌片的制备

（1）最优发酵条件下制备纳豆：选取适量优质大豆，用清水清洗干净，用pH为6的蒸馏水20℃下浸泡一夜（12小时）。将浸泡好的大豆沥干水分，装入烧杯中，厚度为1cm。称其湿重，并按含水量，计算出干重。将烧杯放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃、 0.1Mpa高压蒸煮10min。将煮好的大豆取出，放于室温下，冷却至室温。向大豆中加入大豆干重4%的甘油，混匀。将大豆放入超净工作台中，紫外照射20min。紫外灭菌后，按大豆干重的10%接入纳豆菌。盖上保鲜膜后，将小烧杯放入恒温培养箱中37℃恒温培养24h。发酵结束后，取出小烧杯，放于室温下冷却。待冷却至室温后，放入冰箱中，4℃后熟24h。（2）发酵纳豆的冷冻升华干燥：将后熟好的纳豆取出，在其中加入纳豆质量10％的脫脂乳粉、3.0％麦芽糊精、5％蔗糖和0.5%抗坏血酸，混合均匀。将添加了保护剂的纳豆放入冰箱中，8℃处理5h。将处理好的纳豆放入-51℃条件下预冻，待样品中心温度达到-51℃ 后再在该温度下保持2h，然后转入冷冻干燥机中，在干燥室真空度为30Pa，升华温度为-100℃的条件下干燥40h。取5粒干燥好的纳豆，切碎，放入水份测定仪中，测其水分为6.6%。（3）纳豆粉的调味：将冻干好的纳豆取出，迅速放入粉碎机中进行粉碎，将纳豆磨成粉末。制成的纳豆粉末具有浓烈的臭味，大部分消费者难以接受，尝试向纳豆粉末中添加葡萄糖、食盐、环状糊精、卡拉胶等添加剂对臭味进行掩盖。（4）纳豆粉压片：取一定量的纳豆粉末，在其中加入4.0%的卡拉胶、6.0%的环状糊精、6.0%的葡萄糖和6.0%的食盐，混合均匀。将混合后的粉末放入压片机中，压制成片。

3 讨论

本研究对纳豆的发酵条件进行了优化，采用冷冻升华干燥法，保护了纳豆激酶的活性不被破坏，并对纳豆臭味的掩盖进行了探究。在此基础上，通过大量的试验和数据、图表分析，确定了纳豆发酵的最佳条件和纳豆臭味掩盖的配方。（1）泡豆用水的最佳pH值为6。（2）大豆浸泡时间为20℃下12小时。（3）最佳物料厚度为1cm。（4）发酵时添加最佳碳源为甘油。（5）最佳接种量为10%。（6）纳豆调味的配方为卡拉胶4.0%，环状糊精6.0%，葡萄糖6.0%，食盐6.0%（纳豆粉末干重的质量分数）。

【收稿日期】2011-12-28