家禽养殖场常用消毒剂及消毒效果评价方法研究进展

总结，见表1。

2  消毒剂的选择

家禽养殖生产中最主要的病原微生物为细菌和病毒。不同的病原微生物对消毒剂的敏感性有所差异。消毒剂对细菌和病毒也具有一定选择性，其杀菌、杀病毒能力也参差不齐。因此，针对不同病原微生物的特点选择合适的消毒剂，是消毒成败的关键。虽然消毒剂的种类繁多，但目前尚未存在一种消毒剂具有杀菌广谱、快速、性能稳定、易溶于水、无腐蚀性、无臭无色、刺激性小且价格低廉、不受温度及物理化学因素影响等优点[1]。因此，在疫病防控消毒时，需要针对被消毒病原微生物的性质、消毒剂的特性及需要达到的消毒要求选择消毒剂。

革兰氏阴性菌（如大肠杆菌和沙门氏菌）可产生对消毒剂的抗药性的耐药质粒，因此，革兰氏阳性菌通常比革兰氏阴性菌对消毒剂更敏感[2]。针对革兰氏阳性菌多选用季铵盐类消毒剂，此类消毒剂具有亲脂性，而革兰氏阳性菌的细胞壁含类脂高于革兰氏阴性菌，因此革兰氏阳性菌更容易被该类消毒剂灭活[3];对于难以灭活的细菌芽孢，多选用戊二醛、环氧乙烷、氯制剂和碘伏等便可以达到较好的消毒效果。病毒种类繁多，突变速度快，消毒剂对不同种类的病毒消毒效果差异较大：对于有囊膜的病毒大多数消毒剂都能将其杀灭，然而对于无囊膜的病毒，中效消毒剂（如酚类）和低效消毒剂（如季铵盐类）的杀灭效果较差，因此，多选用高效消毒剂（碱类、醛类、过氧化物类、氯制剂和碘伏等）才能达到有效消毒的效果。

3  消毒效果评价方法

具有良好特性的消毒剂可有效控制禽舍环境卫生、改善禽体健康、增加禽业收益等。因此，对消毒剂的消毒效果评价也成为消毒工作中的一项重要环节。传统的消毒效果评价方法费时费力，影响禽舍消毒完毕后后续工作的开展。近年來，随着分子生物学的发展，多种快速高效的检测技术被开发。

3.1  消毒剂对细菌消毒效果评价  空气沉降菌法是一种方便便捷的细菌消毒检测方法。根据北京市动物养殖消毒效果评价规范地方标准显示，采用空气沉降菌法检测消毒后禽舍的细菌数量，利用5点法布置测点。该标准显示，对有动物舍内空气、舍内物体、厂区道路的平均杀菌率在90%以上为优，80%～84%为合格;对无动物舍内空气、舍内物体、厂区道路的平均杀菌率90%以上为合格[4]。

悬液定量杀菌试验可用于评价消毒剂的杀菌能力，该方法是将指示菌悬液与消毒剂溶液进行定量混合，作用一段时间后，使用中和剂去除残留的消毒剂，随后，定量接种于平皿或倾注培养基内，培育一段时间后进行菌落计数。陈小强利用有限稀释法测定5种消毒剂对参考菌株（大肠杆菌8099）和鸡舍中分离的大肠杆菌的最小杀菌浓度（MBC）;悬液定量杀菌试验测定5种消毒剂对参考菌株的杀灭效果;采用自然沉降法测定鸡舍空气中细菌含量。试验结果表明，过硫酸氢钾复合物粉的MBC值最小，杀菌作用最强;5种消毒剂与菌悬液分别作用1、5、10min，过硫酸氢钾复合物粉对大肠杆菌的杀灭效果最佳。鸡舍现场消毒试验表明，用过硫酸氢钾复合物粉对鸡舍及用具具有显著的消毒效果，消毒后试验组鸡的死亡率比对照鸡群平均下降了2.86%[5]。

Sheridan等人利用荧光定量PCR检测分析经热处理和醇类消毒剂致死大肠杆菌细胞的mRNA，研究结果显示，经热处理的大肠杆菌细胞中目的mRNA片段在2～16h内不会被检测到，醇类消毒剂处理的大肠杆菌细胞中目的mRNA片段在16h后可被检测[6]。笔者认为mRNA在死细胞中存在时间与细菌灭活方式以及死后的保存条件有关，因此在用荧光定量PCR检测前对菌体标本mRNA的时间选择非常重要。Birch比较分析PCR和荧光定量PCR方法评价细胞活性，发现将大肠杆菌O157培养后进行热灭活处理，用肉汤培养和平板培养均无法检测到活菌，然而对不同存放时间的死亡菌体标本利用分子生物学方法进行检测，发现30h后仍然能够检测到目标细菌特殊核酸序列[7]。

不同温度条件下对消毒剂的消毒效果评价结果会有一定差异。朱大兰研究不同温度条件下过氧化氢泡沫消毒剂对杀灭枯草杆菌黑色变种芽孢的效果影响试验，结果表明，在20℃时，作用30、40、50、60min，对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭率分别为81.56%、97.62%、98.12%、99.89%;在30℃时，作用30、40、50、60min，对枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭率分别为99.00%、99.99%、99.99%、100%;在40℃时，作用10、20、30min，对枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭的杀灭率分别达到97.60%、99.99%、99.99%。本研究结果表明，有些消毒剂随着温度升高，可缩短杀灭病原微生物的时间，同一时间点的杀灭率也相应增强[8]。

3.2  消毒剂灭活病毒效果评价  细胞培养评价方法是将病毒利用体外培养的方式获取具有活性的病毒，是一种较为传统的评价病毒消毒效果的手段。目前细胞培养评价方法的研究日益增多[9-10]，但是该方法耗时较长，灵敏度较低。

核酸为病毒的重要组成成分，利用分子生物学方法检测病毒核酸的存在已经成为较为常用的手段之一，该方法检测快速，但对于检测环境要求较高，且容易出现假阳性。Suarez等人利用定量PCR检测多种消毒剂对禽流感病毒消毒效果，发现经酚类和季铵盐类消毒剂消毒后，病毒分离结果提示样本中未检测到禽流感病毒的存在，但经实时定量PCR仍能检测到病毒核酸，猜测这可能是因为此类消毒剂的消毒机制是破坏病毒外壳，而不直接破坏病毒的遗传物质导致，此外过氧化物类消毒剂和含氯消毒剂在合适浓度下能够破坏禽流感病毒的核酸，荧光定量PCR无法检测到病毒核酸[11]。因此，对于病毒消毒效果评价中，需要熟悉所选消毒剂的消毒机理，从而针对性的选择相适应的评价手段。岑斌等人，采用RT-PCR法对203份活禽流通外环境标本进行H7N9病毒核酸检测，以大肠菌群和H7N9病毒核酸检测为辅助评判依据。结果203份外环境标本甲型H7N9流感病毒核酸阳性率为30.0%，其中阳性病例相关家禽圈养点阳性率最高，为61.1%，城乡活禽市场阳性率次之，为51.9%，消毒效果评价以消毒前后自然菌的杀灭率≥90.0%为主要评判依据，结合清洁效果评价、大肠菌群杀灭率和H7N9病毒核酸阴转率为辅助评判依据的综合评定法科学且实用[12]。

反转录巢式PCR是在反转录PCR的基础上发展起来的，在通过反转录获得cDNA的基础上，对目的基因进行巢式PCR扩增。与简单的反转录PCR一样，该方法是用于检测某种RNA是否被表达，或者比较其相对表达水平，但是特异性更高、可靠性更强。于洋选择H9亚型禽流感病毒HA基因为检测靶标，通过设计两对特异性引物，建立了反转录巢式PCR检测方法，添加H9亚型禽流感病毒至土壤进行病毒存活时间的检测试验，在病毒污染土壤后的第5天仍能检测到。随后对相关的消毒剂进行消毒试验效果检测，结果显示，0.075%的戊二醛作用5min、0.05%的戊二醛作用10min对H9亚型禽流感病毒的杀灭率达100%。300mg/L二氧化氯作用2h对H9亚型流感病毒的杀灭率达到100%[13]。

4  总结

消毒是控制感染的一项重要环节，可有效阻断病原微生物的传播。安全高效消毒剂的使用可以帮助减少病原传染的概率，从而增加养殖获益。现阶段，适用于养殖场的消毒剂种类繁多，效果不一。因此合理的选择适合的消毒剂，做好消毒剂配伍使用，选择适当的消毒效果评价方法有助于消毒剂的改进，为养殖消毒剂的正确使用提供相应指导依据。

参考文献：

[1]  马清元， 田旦增， 张婷. 动物防疫常用消毒剂的选择和合理应用[J]. 畜牧兽医杂志， 2015， 34（6）：106-107.

[2]  殷剑. 畜禽养殖场消毒剂的选择[J]. 畜牧兽医科技信息， 2016（9）：47-48.

[3]  谈永新. 畜禽养殖场消毒方法和消毒剂的选择[J]. 水禽世界， 2015（2）：48-49.

[4]  DB11T-1429-2017.动物养殖场消毒效果评价规范[S].

[5]  陈小强.规模化鸡场消毒剂的筛选与消毒效果测定[D]. 杨凌：西北农林科技大学， 2011.

[6]  Sheridan G E C. Detection of mRNA by reverse transcription-PCR as an indicator of viability in Escherichia coli cells.Appl.Environ.Microbiol 1998， 64（4）：1313-8.

[7]  Birch L，Dawson C E，Cornett J H，et al.A comparison of nucleic acid amplification techniques for the assessment of bacterial viability.Letters in Applied Microbiology， 2001， 33（4）：296-301.

[8]  朱大兰.过氧化氢泡沫消毒剂的实验研究[D].长春：中国人民解放军军事医学科学院，2005.

[9]  Ma J F，Straub T M，Pepper I L，et al.Cell culture and PCR determination of poliovirus inactivation by disinfectants.Appl Environ Microbiol， 1994， 60（11）：4203-4206.

[10]  Mbithi J N，Springthorpe V S，Sattar S A. Chemical disinfection of hepatitis A virus on environmental surfaces.Applied & Environmental Microbiology， 1990， 56（11）：3601-4.

[11]  Suarez D，Spackman E，Senne D，et al.The effect of various disinfectants on detection of avian influenza virus by real time RT-PCR.Avian disease， 2003， 47（s3）：1091-1095.

[12]  岑斌，錢小平，盛金芳，等.外环境甲型H7N9流感病毒的消毒及效果评估[J].中国消毒学杂志， 2017（5）.

[13]  于洋.鸡场土壤中H9亚型禽流感病毒的检测与化学消毒剂的筛选[D]. 武汉：华中农业大学， 2012.