正交优化石榴花多糖提取工艺

摘要：采用水提醇沉法提取石榴花中多糖。为优化石榴花多糖提取条件，选取单因素试验中影响差异显著的提取温度、固液比、提取时间和乙醇沉淀最终浓度4个因素，并运用正交试验法优化提取工艺。结果显示，石榴花多糖最佳水提醇沉工艺条件为：提取温度95 ℃、提取时间3 h、固液比1∶20（g∶mL）、乙醇濃度80%醇沉。其中提取温度、固液比、提取时间及醇沉终浓度对多糖得率影响依次减小。

关键词：石榴花；多糖；正交试验；提取优化

中图分类号：R284.2；TQ461 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）20-3929-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.033

Abstract： Pomegranate flowers as row material were used for extraction of polysaccharide with water and alcohol. In order to optimize extraction conditions for polysaccharide， on the basis of single factor experiments， the orthogonal experiment were used to design the four factors， including extracting temperature， extracting time， solid-liquid ratio and final concentration of ethanol precipitation. The optional conditions were as follows： water temperature of 95 ℃， an extraction time of 3 h， solid-liquid ratio of 1∶20（g∶mL）， ethanol precipitation concentration of 80%. The effects of extraction temperature， solid-liquid ratio， extraction time and final concentration of alcohol precipitation on the yield of polysaccharides decreased in turn.

Key words： pomegranate flowers； polysaccharides； orthogonal experiment； extraction optimization

石榴（Punica granatum L.）为石榴科石榴属植物，其浆果营养价值很高。目前在中国已形成山东枣庄、安徽怀远、河南荥阳、四川会理、陕西临潼、新疆叶城和云南蒙自7大石榴主产地[1]。其中山东枣庄已拥有10余万亩的石榴栽种面积，40个石榴品种，被誉为“冠世榴园”。石榴5～7月开花，石榴花不仅观赏价值和文化价值较好，其药用价值也逐渐成为研究热点。石榴花的药用价值早在《本草纲目》[2]中记有“榴花主治：阴干为末，和铁丹（即铁粉）服一年变白发如漆。干叶治心热吐血，又研末塞鼻止衄血，亦傅金疮出血”。《中药大辞典》记载其主治中耳炎、鼻衄、肺痈和创伤出血，可内服亦可外用。维吾尔族医疗中常用于治疗白内障、恶心及神经衰弱等，素称“古丽娜”[3]。研究表明，石榴花抗氧化活性较高[4]，可用于降血脂及降血糖[5]。而石榴开花量大，常分3批开花，刚现蕾时需疏除不结实的钟状花，后期部分二花及所有三花也需疏除大部分，其价值没有得到充分的利用[3]。石榴花不仅含有多酚、黄酮及萜类物质，还含有多糖成分。多糖在自然界中广泛存在，因其具有多种生物活性而被广泛作为中草药的有效成分，可用于抗肿瘤[6]、降血糖[7]、降血脂[8]、抗辐射[9]、抗菌抗病毒[10]等。多糖类药物的研制已逐步成为世界新药发展的一大方向[11，12]。目前有关植物多糖提取的研究已有许多报道，而对于石榴花多糖提取的研究较少，为了合理开发和利用石榴花多糖，本研究根据单因素的试验结果，利用正交试验对石榴花多糖的提取条件进行优化，确定最优提取工艺，为今后石榴花多糖的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴花样品（品种为岗榴）于2014年6月采自枣庄学院校园，由枣庄学院生命科学学院植物学教研室李思健副教授鉴定为石榴科石榴属植物石榴的花，样品于40 ℃恒温烘干，置于冰箱储存备用。

苯酚、浓硫酸、氯仿、甲醇、无水乙醇等为国产分析纯；葡萄糖标准品购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2600紫外可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]；FA110413电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；LK-2000A组织捣碎机（新昌县红利机械有限公司）；HH-S4恒温水浴箱（常州普天仪器制造有限公司）；16L-206高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 石榴花多糖提取工艺 石榴花→清洗→烘干→粉碎至200目→氯仿∶甲醇（2∶1）45 ℃脱脂→脱单糖→干燥→热水提取→离心→上清液→浓缩→醇沉→离心→沉淀去乙醇→烘干→石榴花粗多糖。

1.3.2 标准曲线的绘制 多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[13]，称取干燥至恒重的葡萄糖标准品20 mg，加水溶解定容至250 mL，配成80 μg/mL的母液。分别吸取葡萄糖标准溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，置于具塞试管中，各加去离子水至1.0 mL，加入浓度为5%的苯酚0.5 mL，迅速滴加浓硫酸2.5 mL，摇匀，室温放置40 min后于490 nm处测吸光度（以去离子水1.0 mL加苯酚和硫酸作参比）。同一浓度的标准溶液设3个重复。横坐标为葡萄糖浓度，纵坐标为吸光度绘制标准曲线，并求得回归曲线等。

1.3.3 石榴花多糖得率计算

得率=×100%。其中，M1为石榴花原料的质量（g）；M2为多糖的质量（g）。

1.4 工艺优化试验说明

1.4.1 单因素试验 脱脂、脱单糖石榴花粉末，提取温度分别设定为65、75、85、95、100 ℃，提取时间分别为1、2、3、4、5 h，固液比（g∶mL）分別为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，提取液加乙醇醇沉的最终浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%，分别考察其对石榴花多糖得率的影响，确定最佳的提取条件。

1.4.2 正交优化试验 在单因素试验基础上，分析提取温度、固液比、提取时间、醇沉终浓度这4个因素的3个水平间相互关系，以优化提取条件，选择L9（34）正交表，设计方案见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度对多糖得率的影响 分别准确称取5份1.000 g脱脂、脱单糖石榴花粉末于100 mL锥形瓶中，按固液比（g∶mL）1∶30加去离子水后，分置于梯度温度的各水浴锅中浸提3 h，离心后取上清液测其多糖含量，结果如图1所示。由图1可知，在65～95 ℃温度范围内，随着温度的升高，多糖得率提升幅度较大。当温度升高至100 ℃时，得率反而下降，可能是由于温度过高，杂质溶出增多，影响多糖的溶解，得率下降。综合考虑选取提取温度为80～95 ℃。

2.1.2 提取时间对多糖得率的影响 分别准确称取5份1.000 g脱脂、脱单糖石榴花粉末于100 mL锥形瓶中，按固液比（g∶mL）1∶30加去离子水后，置于85 ℃恒温水浴锅中，分别浸提1、2、3、4、5 h，离心后取上清液测其多糖含量，结果如图2所示。由图2可知，在1～3 h时，多糖得率增加的幅度较大，超过3 h后，多糖得率增幅较缓，对效能综合考虑后选取提取时间为1～3 h。

2.1.3 固液比对多糖得率的影响 分别准确称取5份1.000 g脱脂、脱单糖石榴花粉末于100 mL锥形瓶中，依次按固液比（g∶mL）1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加去离子水后，置于85 ℃恒温水浴锅中浸提3 h，离心后取上清液测其多糖含量。从图3可以看出，在固液比1∶10～1∶20时随着提取溶剂的增加，多糖得率上升，固液比超过1∶20后提取效果呈降低趋势，这可能是由于后期溶液浓缩时间过长所致。

2.1.4 醇沉终浓度对多糖得率的影响 分别准确称取5份1.000 g脱脂、脱单糖石榴花粉末于100 mL锥形瓶中，按固液比（g∶mL）1∶20加去离子水后，置于85 ℃恒温水浴锅中浸提3 h，离心取上清液加入无水乙醇，使乙醇终浓度依次为50%、60%、70%、80%、90%。结果（图4）发现醇沉终浓度为50%时多糖析出不明显，而在60%～90%范围内随乙醇浓度增大，多糖析出不断增加，但因乙醇用量大而致使成本升高。

综合考虑各种因素，本试验选取提取时间、提取温度、固液比（g∶mL）和醇沉终浓度为主要影响因素，各因素对应水平依次为：1、2、3 h；85、90、95 ℃；1∶10、1∶20、1∶30；70%、80%、90%。

2.1.5 提取次数对多糖得率的影响 准确称取1.000 g脱脂、脱单糖石榴花粉末于100 mL锥形瓶中，依次按固液比（g∶mL）1∶30加去离子水后，置于85 ℃恒温水浴锅中浸提3 h，过滤后取上清液测其多糖含量；滤渣重复提取3次，检测每次浸提液中多糖含量。结果（图5）表明，随浸提次数的增加，多糖得率不断增加。但1次提取的提取率已基本稳定，再增加提取次数对多糖提取率影响不大，而成本增加较大，故选择1次提取。

2.2 正交试验

按正交试验设计的方案对石榴花多糖醇沉工艺优化的结果见表2。由表2可知，试验因素的主次顺序为A（提取温度）>B（液固比）>D（提取时间）>C（醇沉终浓度），最优水平搭配为A3B1C2D3。即温度95 ℃，固液比1∶20，醇沉终浓度80%，提取时间3 h。为了直观起见，用因素的水平变化为横坐标，指标的平均值为纵坐标，作水平与指标关系图，如图6所示。由极差分析得知，提取温度是影响石榴花多糖提取率的最显著因素，其次是固液比、提取时间及醇沉终浓度。

3 小结

本研究对影响石榴花多糖提取的提取时间、固液比、温度、次数和醇沉终浓度做了单因素试验。在此基础上，对提取时间、固液比、提取温度和醇沉终浓度4个因素进行了正交试验。极差分析表明，提取温度和液固比对石榴花多糖提取的影响最大，其次是提取时间和醇沉终浓度。本研究中石榴花提取所得多糖为粗多糖，而多糖的纯度直接关系到多糖类物质具有的高生物活性。后期将对粗多糖进一步除杂，分离纯化得到高纯度多糖，并深入探究多糖的组成和结构，有关这方面的工作有待进一步报道。

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