高效液相色谱串联蒸发光散射检测器测定梨中单双糖含量的研究

材料与方法

1.1 材料

黃金梨（新疆产）、黄冠梨（河北产）、雪花梨（河北产）均购于长春市共和果品超市;果糖、葡萄糖和蔗糖购自上海国药化学试剂公司，甲醇为色谱纯试剂，购自美国热电飞世尔科学有限公司;二次蒸馏水为自制;其他均为国产分析纯试剂。

1.2 定性用对照品溶液的配制

分别称取1.25g果糖、葡萄糖、和蔗糖对照品，置于50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，摇匀。以0.45μm孔径的微孔滤膜过滤（聚醚砜，MEMBRANA公司），吸取20μL滤液用于高效液相色谱分析。

1.3 定量用对照品溶液的配制

分别精密称取果糖、葡萄糖、蔗糖对照品1.00g，置于3个50mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，摇匀。作为母液备用。

将果糖、葡萄糖、蔗糖母液分别按浓度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg/mL）进行稀释。以0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，吸取20μL滤液用于高效液相色谱分析。

1.4 样品处理及待测溶液的制备

1.4.1 样品的冷冻干燥处理

分别将3个不同品种的梨称重，切成小块，经组织捣碎机（HGB2WTS3，Waring）粉碎5min，将粉碎后的浆均匀倒入玻璃皿成2mm左右的薄层，称重，置于冰箱（Simens，博西华家用电器公司）冷冻层-20℃冷冻1h，再经过真空冷冻干燥机（FDU-2100，日本东京理化株式会社）干燥24h，快速放置于玻璃干燥器中，依次快速称重，快速用研钵磨碎用保鲜膜封存于玻璃干燥器中备用。

1.4.2 样品的烘干干燥处理

分别将3种不同品种的梨采用上述1.4.1操作冷冻1h后不进行冷冻干燥，直接在105℃的烘箱中过夜烘干，之后快速置于干燥器中，待冷却至室温，称重。

1.4.3 样品的测定

快速称取上述样品粉末0.10g于50mL容量瓶中，加入适量乙腈：水（1：1）混合溶液，在超声波清洗机中（舒美KQ-300VDE，昆山超声仪器公司）70℃，45KHz超声提取0.5h，冷却至室温后，再补充乙腈：水（1：1）定容至刻度线，并摇匀[5，6]。以0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，所得滤液用于高效液相色谱分析。平行试验3次。

1.5 色谱条件

高效液相色谱仪（Dionex P680 HPLC pump，美国戴安公司）;ZORBAX Carbohydrate色谱柱（安捷伦4.6 mm×150 mm， 5-Micron，美国）;流动相，乙腈：水（80 ： 20 v/v）;流速，1.0mL/min;柱温：30℃;进样体积：20μL。

1.6 蒸发光散射检测器条件

蒸发光散射检测器（Alltech 3300 ELSD，美国奥泰公司）条件：漂移管;温度：100℃，氮气为辅气（流量：1.8L/min）。

1.7 统计分析

采用SPSS23.0统计分析软件进行数据处理。数据表示为平均值加减标准差，采用LSD法对黄金梨、皇冠梨和雪花梨的果糖含量、葡萄糖含量和蔗糖含量进行多重比较（P<0.05）。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

真空冷冻干燥技术能够有效的除去水分，且经该技术处理的样品营养成分损失少[7]。所以，本研究采用真空冷冻干燥法对样品进行处理。

经真空冷冻干燥后的黄金梨、黄冠梨、雪花梨失去的水分占总质量的比值，分别达83.66%、87.77%和87.66%。经105℃过夜烘干后的样品黄金梨、黄冠梨、雪花梨失去的总水分占总质量，分别达84.66%、89.01%和89.68%。从中可以看出，烘箱干燥处理的样品失水量比真空冷冻干燥稍大，但差别保持在2.5%之内。且烘箱干燥处理后的样品由于高温处理，样品发生了褐变，糖组分及含量的变化影响了样品中糖含量的测定。而真空冷冻干燥处理的样品可以有效除去水分，其他营养成分损失少。所以本研究采用真空冷冻干燥处理样品。

梨中主要糖分果糖、葡萄糖、蔗糖都易溶于水，升高温度可以提高糖的溶解度。使用超声提取法用乙腈：水（1：1）溶液浸提样品中糖分，可以使糖分子充分浸出，防止梨中糖分未完全浸出而带来的误差。所以本实验采用浸提温度为70℃，超声时间0.5h[8]。

2.2 标准曲线的制定

将1.2中高效液相色谱分析结果得出的3种糖标准谱图，按上述1.5色谱条件测定峰面积。分别以果糖、葡萄糖、蔗糖梯度浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，回归方程及相关系数见表1。3种糖的标准谱图详见图1、图2、图3。从3种标准品的谱图中可以看出3种糖在15min内全部出峰，果糖最先出峰，在7.098min，葡萄糖在8.148min出峰，蔗糖出峰时间最迟，在11.747min。

2.3 样品色谱图

按照1.5色谱条件对3种不同品种的梨中果糖、葡萄糖、蔗糖进行测定，样品色谱图如图4、图5、图6所示。

用高效液相色谱分离3种糖的样品谱图结果表明，本试验所采用的色谱条件可以很好地分离果糖、葡萄糖和蔗糖。3个样品谱图中果糖出峰时间最早，在7.549min左右，葡萄糖出峰时间在8.512min左右，蔗糖出峰时间最晚在12.321min左右，达到了基线分离效果，色谱基线稳定。比较果糖、葡萄糖和蔗糖标准品的谱图，可以看出，样品的出峰时间比标准品的出峰时间稍晚一些。

宋晓晖[1]和姚改芳[9，10]的研究结果表明，梨果实中主要糖分为果糖、葡萄糖和蔗糖。与本试验得出的结果一致。姚改芳[9]的研究中，采用高效液相-示差折光检测器测定梨果实样品色谱图中3种糖的出峰顺序依次为蔗糖、葡萄糖、果糖;与本研究采用高效液相-蒸发光散射检测器检测法测定梨样品中3种糖的出峰顺序不同。宋晓晖等[1]的研究，采用高效液相-蒸发光散射器测定样品梨果实中糖含量，为了使梨样品色谱图中山梨糖醇和葡萄糖达到更好的分离效果，分别在不同柱温、流动相流速和流动相比例条件下，测定梨样品色谱图。而本研究确定的色谱条件，色谱图中不会检测到山梨糖醇，从而避免了山梨糖醇对葡萄糖的影响。

2.4 精密度实验

分别将果糖、葡萄糖、蔗糖对照品配制成浓度为0.08、0.08、0.04mg/mL的溶液，以0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，吸取适量滤液用于高效液相色谱分析，按上述1.5色谱條件测定峰面积，外标法定量计算果糖、葡萄糖、蔗糖浓度的相对标准偏差（RSD，n=6），相对标准偏差（RSD）均小于2.7%。故使用HPLC-ELSD法测梨中果糖、葡萄糖、蔗糖精密度较好。详见表2。

2.5 3种梨样品中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量

分别取3个品种的梨样品，按上述1.4方法处理后，以上述1.5色谱条件平行测定4次（n=4），结果详见表3。

从表3中可以看出，黄金梨、黄冠梨、雪花梨中均含有大量果糖、葡萄糖、蔗糖。黄冠梨、雪花梨果糖含量最高，分别占梨含量的6.52%和6.82%;其次为葡萄糖，占梨含量的5.08%和4.16%;蔗糖含量最少，占梨含量的3.44%～2.80%。而在黄金梨中葡萄糖最多，占梨含量的6.32%;果糖次之，占梨含量的6.32%;蔗糖含量最少，占梨含量的2.13%。3种梨中总糖含量由小到大以此为：雪花梨、黄冠梨、黄金梨。3种不同品种的梨果糖含量无明显差异，葡萄糖、蔗糖含量有显著差异，这可能是由于梨的品种及其生长地、日照时间、气候条件、人为施肥程度、成熟度等因素造成的。

结果表明，黄金梨属于高果糖、高葡萄糖型，这与宋晓晖等人[1]的研究中新疆梨属于高果糖、高葡萄糖型相一致。黄冠梨果糖含量最高，蔗糖含量最少，属于高果糖型;宋晓晖等[1]的研究结果：黄冠梨中果糖占总糖含量最高，达30%左右，蔗糖占总糖含量最少达8.69%左右，属于高果糖、低蔗糖型。雪花梨果糖含量最高，属于高果糖型，蔗糖含量最低;高海洋等[11]的研究结果：雪花梨梨汁中果糖含量最高，可达70.49g/L，蔗糖含量最低，达1.638g/L，说明雪花梨为高果糖、低蔗糖型。这表明本实验以黄金梨、皇冠梨和雪花梨为材料，分析处理得出结果与他人研究得出的结果相一致。

3 结论

对3个不同品种梨利用组织捣碎机磨成果浆，然后采用真空冷冻干燥技术预处理，乙腈：水（1：1）超声波提取果糖、葡萄糖和蔗糖，再利用HPLC-ELSD法进行定量分析，结合SPSS统计分析软件，通过差异性可以准确的分析出梨中可溶性糖的组分（主要为葡萄糖、果糖和蔗糖）、含量和不同品种梨中同种糖的差异性比较。本实验采用的方法可用于梨中糖含量的质量分析与控制，具有实用价值。

参考文献

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[10] 姚改芳，张绍铃.10个不同系统品种的可溶性糖与有机酸组分含量分析[J].南京农业大学学报，2011，34（5）：25-31.

[11] 高海燕，王善广.不同品种梨汁中糖与有机酸含量测定及相关性分析[J].华北农学报，2004，19（2）：104-107.

作者简介：

王勇（1993-），男，在读硕士研究生。研究方向：食品生物技术。