棉花黑斑病病原鉴定及生防木霉菌株的筛选

摘要：从河南省部分地区感染黑斑病的棉花叶片上分离病原菌，并对其致病力、病原及其生防木霉菌株进行了研究。共分离到５株棉花黑斑病菌株。致病力分析表明，ＣＨＢ－３的致病力比较强，病情指数达到89．３。对Ｙ２１ｃ菌株的核糖体ＲＮＡ基因内转录间隔区进行ＰＣＲ扩增和序列测定，并在ＧｅｎＢａｎｋ中进行Ｂｌａｓｔ搜索和比对分析，根据ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析结果并结合病菌的形态学特征，初步认为河南省棉花黑斑病的病原菌为细极链格孢菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ）。利用平板对峙培养测定了７个木霉菌株对棉花黑斑病菌株ＣＨＢ－３的拮抗作用，筛选到抑菌作用较好的木霉菌株ＴＨ，抑菌率为８８．６％。

关键词：棉花；黑斑病；木霉；ｒＤＮＡ－ＩＴＳ

中图分类号：Ｓ４３６．４２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）09－1793-04

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｃａｕｓｉｎｇ Ｃｏｔｔｏｎ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ Ｌｅａｆ Ｓｐｏｔ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ Ｓｔｒａｉｎｓ

ＣＨＥＮ Ｋａｉ１，ＬＩＵ Ａｉ－ｒｏｎｇ１，２，ＷＵ Ｓｈａｎｇ－ｙｉｎｇ１，ＬＩＮ Ｘｉａｏ－ｍｉｎ１，ＸＵ Ｔｏｎｇ２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｈｅｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｕｏｙａｎｇ ４７１００３， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２９， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ has ｓｐｒｅａｄ ａｒｏｕｎｄ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅｌｙ ａｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ． Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｖｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ by Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｍｅ ａｒｅａｓ ｏｆ Ｈｅｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｆｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ and ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ， ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ． Ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｎｆｒｏｎｔｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ， ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｖｅｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ａｇａｉｎｓｔ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ． ＴＨ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｅｈａｖｅｄ ｂｅｓｔ as ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ８８．６％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｔｔｏｎ； Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ； Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ； ｒＤＮＡ－ＩＴＳ

棉花黑斑病是世界范围内广为传播的一种常见的棉叶侵染性病害［１］，又称棉花轮纹病，俗称腰折病，多发于棉花子叶、真叶以及幼苗期。它的病原体为半知菌亚门大链格孢属真菌，被称为棉花轮纹菌或棉花黑斑病菌。它是棉花苗期叶部病害中分布最广、流行面积最大、流行频率最高的病害，阴湿多雨年份往往猖獗流行，给棉花生产造成毁灭性灾害［１，２］。

棉花黑斑病的病原菌有多种，其中以大孢链格孢菌（Ａ． ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ Ｚｉｍｍ．） 、细极链格孢菌（Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ Ｗｉｌｔｓｈ．）、棉链格孢菌［Ａ． ｇｏｓｓｙｐｉｎａ （Ｔｈｕｍ．） Ｈｏｐｋ．］、细交链孢菌［Ａ． ａｌｔｅｒｎａｔａ （Ｆｒ．） Ｋｅｉｓｓｌ．］等为常见种［２］。不同病原菌间致病力不同，大孢链格孢菌致病力最强。目前，棉花黑斑病病原菌研究多集中在发病条件和化学防治方面，对其病原菌的鉴定及生物防治报道较少，还没有关于河南地区棉花黑斑病病原田间致病力和生物防治的研究报道。本研究从河南省部分地区感染黑斑病的棉花叶片上采集并分离病原菌，并对其致病力、病原及其生防木霉进行了研究，以期为棉花黑斑病的生物防治奠定理论基础。

１材料与方法

１．１材料

棉花黑斑病菌由本课题组分离。哈茨木霉菌菌株ＴＡ、ＴＤ、ＴＧ、ＴＨ、ＴＩ、ＴＭ及ＴＸ，由浙江大学徐同教授馈赠。供试棉花品种为新植１号。

１．２棉花黑斑病菌的分离

从洛阳、三门峡、周口市和河南省农业科学院的田间采集发病较重且症状典型的棉花叶片，取病健交界处组织，先用体积分数为７５％的乙醇消毒３０ ｓ，再用质量分数为１％的ＮａＣｌＯ消毒５ ｍｉｎ，用无菌水清洗。消毒后的组织块置于ＰＤＡ平板培养基上，２５℃恒温培养２ ｄ，长出真菌菌落后挑取边缘菌丝单孢纯化，分离纯化得到的菌株接种到ＰＤＡ斜面培养基上。

１．３病原菌的形态学鉴定

分离纯化后的菌落产孢后，挑取少量菌丝和分生孢子，观察菌丝及分生孢子形态，测量分生孢子的长、宽、分隔数及孢子梗的有无、长短，每个处理至少测量３０个孢子，并对照文献［３］进行形态鉴定。

１．４病菌对棉花幼苗的致病力测定

幼苗４～５片真叶时，用灭菌后的蒸馏水将枝条及叶片冲洗干净，再用湿润纱布轻搓叶片表面，去除表面蜡质。采用喷雾法将孢子悬浮液均匀喷洒在叶片表面，病原菌孢子悬浮液浓度为１０８个／ｍＬ，以清水作对照。重复３次，每重复２０株。将处理后的棉花植株放入人工气候箱中，并用塑料袋将整株罩住。温度、相对湿度、光照时间分别设置为２９℃、９０％和１５ ｈ。１４ ｄ后调查发病情况，统计病情指数。

病情分级：０级，无病症；１～５级分别为病斑占叶片表面积的０～２０％、２１％～４０％、４１％～６０％、６１％～８０％和８１％～１００％。

病情指数＝［∑（各级病叶数×各级代表值）/（调查总叶数×最高级代表值）］×１００

１．５病菌核糖体ＲＮＡ基因内转录间隔区序列比较

以ＣＴＡＢ法提取病菌总ＤＮＡ。ｒＤＮＡ－ＩＴＳ扩增选用的引物为ＩＴＳ４（５’－ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣ－３’）和ＩＴＳ５（５’－ＧＧＡ ＡＧＴ ＡＡＡ ＡＧＴ ＣＧＴ ＡＡＣ ＡＡＧ－３’）。ＰＣＲ反应体系含ＤＮＡ模板１．００ μＬ（约１０ ｎｇ）、１０×缓冲液（１ ０００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ ｍｍｏＬ／Ｌ ＫＣｌ）２．５０ μＬ、Ｍｇ２＋（２５ ｍｍｏＬ／Ｌ ＭｇＣｌ２）１．８０ μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｅａｃｈ） ２．５０ μＬ、引物（２ μｍｏＬ／Ｌ）各1．００ μＬ、Ｔａｑ酶１．２５ μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ至２５．００ μＬ。反应程序为：９４℃预变性２ ｍｉｎ；９４℃变性４０ ｓ，５４℃退火４０ ｓ，７２℃延伸４０ ｓ，共３５个循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ。反应产物在质量浓度１．２％琼脂糖凝胶上电泳检测（１２０Ｖ，３０ ｍｉｎ）。扩增的ＰＣＲ产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

１．６木霉拮抗菌株的室内筛选

采用对峙培养法。木霉菌和病原菌ＣＨＢ－３于２８℃活化３ ｄ。挑取直径５ ｍｍ的病原菌菌块，接种到新制ＰＤＡ平板左侧，再将木霉菌块接种到平板右侧。以只接种病原菌平板作对照，每处理３次重复。２８℃恒温培养６ ｄ，每天记录病原菌落指向木霉菌半径以及对照病原菌菌落半径，计算抑菌率。

抑菌率＝［（病原菌对照菌落半径－病原菌落指向木霉菌半径）/病原菌对照菌落半径］×１００％

拮抗系数的分级标准（５级）［４］：Ⅰ级，木霉菌丝占平皿面积的１００％；Ⅱ级，木霉菌丝占平皿面积的２／３以上；Ⅲ级，木霉菌丝占平皿面积的１／３～２／３；Ⅳ级，木霉菌丝占平皿面积的１／３以下；Ⅴ级，病原菌丝占平皿面积的１００％。

１．７数据处理

应用ＤＰＳ ｖ ７．０５软件进行数据分析，采用邓肯氏法进行差异显著性检验。

２结果与分析

２．１棉花黑斑病病原菌致病力比较

从采集到的标本中共分离到５株病原菌，分别编号为：ＣＨＢ－１、ＣＨＢ－２、ＣＨＢ－３、ＣＨＢ－４、ＣＨＢ－５。将病菌孢子悬浮液喷洒于健康叶片，接种４８ｈ后部分植株叶面出现红褐色小圆斑，以幼嫩叶片为主。此后病斑逐渐明显，扩展成不规则形至近圆形褐色斑，清水对照未发病。接种后第六天计算不同菌株的病情指数，结果表明不同菌系之间的致病力存在极显著差异，ＣＨＢ－３的致病力比较强，病情指数达到８９．３（表１）。

２．２病原菌的形态学鉴定

在ＰＤＡ培养基上接种病原菌后，菌丝呈放射状向外生长，后呈圆形，边缘整齐。菌落淡褐色，生长茂密，没有气味。菌落生长后期，有明显环状轮纹，背面中心有褐色代谢产物产生（图１）。分生孢子倒棍棒形，部分孢子卵圆形或倒梨形，基部圆，暗褐色，嘴孢短，成串着生，有横隔１～９个，纵隔０～６个，隔膜处缢缩，大小１２．５～４２．５ μｍ×６．０～１２．５ μｍ。根据形态学数据将ＣＨＢ－３初步鉴定为半知菌亚门，丛梗孢目，暗色孢科，链格孢属真菌［５，６］。

２．３棉花黑斑病菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ的扩增及序列比较

以病菌总ＤＮＡ为模板，用通用引物ＩＴＳ４和ＩＴＳ５分别对致病力较强的ＣＨＢ－２、ＣＨＢ－３、ＣＨＢ－５菌株的ＩＴＳ区段进行扩增和序列测定，拼接后分别得到长度为５９６、５８５、５７４ ｂｐ的序列。采用ＤＮＡＭＡＮ５．２．２软件对测得的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列进行比对，发现这３株真菌的ＩＴＳ序列完全相同。通过Ｂｌａｓｔ搜索，发现与所测菌株的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列相似率为１００％的序列（表２）中，有4个来自细极链格孢（Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ），５个来自烟草赤星病菌（Ａ． ａｌｔｅｒｎａｔa），５个来自链格孢属真菌（Ａ． ｓｐ．），４个来自未鉴定的子囊菌，１个长柄链格孢（Ａ． ｌｏｎｇｉｐｅｓ）和１个苹果轮斑病菌（Ａ． ｍａｌｉ）。根据棉花病株症状及病菌的形态特征，结合ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析，所分离的棉花黑斑病病原菌鉴定为细极链格孢（Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ）。

２．４木霉菌对黑斑病原菌的抑制作用

对峙培养２～３ ｄ木霉菌即表现出对病原菌ＣＨＢ－３的抑制作用。培养４ ｄ后木霉菌与病原菌接触，木霉菌和病原菌之间形成了较明显的抑制圈，大部分木霉菌在与病原菌的对峙中形成了对抗生长局面。随着时间的推移，被包围的病原菌有些边缘塌陷，菌落背面褐色加深，生长受到抑制。培养到第六天时与枯萎病菌形成了明显的抑菌圈。其中ＴＡ和ＴＨ菌株覆盖或侵入了黑斑病菌ＣＨＢ－３菌落，拮抗作用较强（图２）。

各菌株对棉花黑斑病菌ＣＨＢ－３的抑制作用存在差异，当木霉菌接种６ ｄ时，对病原菌的抑菌率在５６．７％～８８．６％之间。其中木霉菌ＴＨ对黑斑病菌ＣＨＢ－３具有较强的抑制作用，抑菌率为８８．６％，拮抗系数为Ⅰ～Ⅱ级；ＴＡ菌株的抑菌效果次之（表３）。

３讨论

黑斑病是棉花苗期叶片病害中分布最广，危害最大，流行频率最高的一种毁灭性病害，在我国主要产棉区都有发生，尤其是北方棉区，在阴湿多雨年份极易发生流行。对棉花黑斑病的研究主要是利用化学杀菌剂和预处理非致病性生防制剂。Ｓｈｔｉｅｎｂｅｒｇ 等［7］的研究表明，系统性杀菌剂（戊唑醇）和保护性杀菌剂（代森锰）对棉花黑斑病均具有较好的防治效果，不同杀菌剂对碧玛棉产量和生长没有显著影响，但系统性杀菌剂在抑制已感染病害上具有更好效果。Ｊａｂａｊｉ－Ｈａｒｅ等［８］研究了非致病性的双核丝核菌和苯并噻二唑（ＢＴＨ）对棉花黑斑病的防治效果，结果表明非致病性的双核丝核菌防病效果要优于ＢＴＨ，且两者在抗病中具有协同作用。本研究进行了棉花黑斑病病原菌的分离、形态鉴定，并基于ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列进行了分子鉴定，并首次利用哈茨木霉对其进行了室内抑菌研究。

木霉菌是重要的植物病害防治菌，它可通过重寄生、抗生溶菌作用、竞争作用、诱导抗性及促进植物生长等机制抑制真菌病害［９］。本试验研究了７个哈茨木霉菌株对棉花黑斑病病原菌的拮抗作用，并筛选得到较理想的拮抗木霉菌株ＴＨ和ＴＡ。目前木霉菌在实验室、温室控制条件下或田间小型试验中已获得较好的防治效果，但与在大田应用还有较大的差距。主要是田间环境条件复杂，如土壤物理化学因素、土壤微生物、植物根系和气象因素等［１０］。本试验结果为将哈茨木霉菌株ＴＨ和ＴＡ等开发成生防制剂提供了依据，但关于ＴＨ和ＴＡ等菌株防治田间棉花黑斑病的施用方法、次数和剂量等尚待进一步探讨。

参考文献：

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［３］ 魏景超． 真菌鉴定手册［Ｍ］． 上海：上海科学技术出版社，１９７９．１－７８０．

［４］ ＢＥＬＬ Ｄ Ｋ， ＷＥＬＬＳ Ｈ Ｄ， ＭＡＲＫＨＡＭ Ｃ Ｒ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｉｘ ｆｕｎｇａｌ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９８２，７２（４）：３７９－３８２．

［５］ 巴尼特Ｈ Ｌ， 亨特Ｂ Ｂ． 半知菌属图解［Ｍ］． 沈崇尧，译．北京：科学出版社，１９７７．１－２４０．

［６］ 张天宇． 中国真菌志：第十六卷：链格孢属［Ｍ］． 北京：科学出版社，２００６．３３０－３３９．

［７］ ＳＨＴＩＥＮＢＥＲＧ Ｄ， ＤＲＥＩＳＨＰＯＵＮ Ｊ． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｉｎ ｐｉｍａ ｃｏｔｔｏｎ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ［Ｊ］． Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，１９９１，１０（５）：３８１－３８５．

［８］ ＪＡＢＡＪＩ－ＨＡＲＥ Ｓ， ＮＥＡＴＥ Ｓ Ｍ． Ｎｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂｉｎｕｃｌｅａｔｅ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ． ａｎｄ Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ ｐｒｏｔｅｃｔ ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｄａｍｐｉｎｇ－ｏｆｆ ａｎｄ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２００５， ９５（９）： １０３０－１０３６．

［９］ ＬＩＥＶＥＮＳ Ｂ， ＣＬＡＥＳ Ｌ， ＶＡＫＡＬＯＵＮＡＫＩＳ Ｄ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｒｏｂｕｓｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ ａｎｄ ｆ． ｓｐ． ｒａｄｉｃｉｓ－ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ［Ｊ］． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，９（９）：２１４５－２１６１．

［１０］ ＢＵＲＭＥＩＳＴＥＲ Ｌ， ＨＡＵ Ｂ． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅａｎ ｒｕｓｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ： ｌｅａｆ ｄｉｓｃ ａｓｓａｙｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｐｏｒｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅｓ［Ｊ］． ＢｉｏＣｏｎｔｒｏｌ， ２００９，５４（４）：５７５－５８５．