诺沃霉素植生链霉菌发酵培养基的优化

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 植生链霉菌（Streptomyces phytohabitans）HBERC-20821，由湖北省生物农药工程研究中心分离保存。

1.1.2 培养基 斜面培养基：ISP-2培养基。采用18 mm×180 mm玻璃试管，每管装琼脂培养基8～10 mL。

种子培养基（g/L）：甘露醇20；大豆蛋白胨10；磷酸氢二钾0.35；碳酸钙0.5；豆油1； pH 7.0。采用500 mL带档板三角瓶，每瓶装培养基100 mL，121 ℃灭菌30 min。

对照发酵培养基（g/L）：同种子培养基。

1.1.3 试验仪器 大振幅摇床SPH-3222（上海世平实验设备有限公司）；高速离心机GL21M（长沙湘智离心机仪器有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（Waters 2996二极管阵列式检测器）；自动发酵罐BIOTECH-20-200JS（上海保兴生物设备工程有限公司）；天平JY6002电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪RE-2000（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的摇瓶发酵 在无菌条件下，从斜面取8～10 mm的菌饼转移至种子摇瓶中，在28 ℃，150 r/min旋转式摇床上，振荡培养96 h，然后按10%（V/V）的接种量转接至发酵培养基中，将培养基置于28 ℃、150 r/min大振幅摇床上，振荡培养120～144 h，即完成发酵。

1.2.2 发酵液镜检及提取 取少量发酵液测量pH并进行镜检，再向摇瓶中加入100 mL乙酸乙酯后，于180 r/min大振幅摇床上振荡萃取1 h，离心分离出酯相，旋蒸，除去溶剂，再以1 mL甲醇溶解后，进行HPLC分析。

1.2.3 产物的高效液相色谱（HPLC）分析 采用Sunfire C18色谱柱，150 mm×2.1 mm（i.d），粒径3.5 μm，柱温40 ℃，进样量为2 μL，流动相为去离子水和色谱纯乙腈，梯度洗脱，检测波长为260 nm[6]。

1.2.4 HPLC分析结果的处理 根据HPLC紫外吸收光谱结果，可由出峰时间确定产物组分，由峰面积确定对应组分产量[7]。

1.2.5 摇瓶发酵培养基优化[8] 碳源单因素试验：只改变原培养基中碳源，其他组分、培养条件保持不变，按照“1.2.1”方法进行摇瓶试验。

氮源单因素试验：只改变原培养基中氮源，使用最佳碳源，其他组分、培养条件保持不变，按照“1.2.1”方法进行摇瓶试验。

碳氮源最佳比例的探索：在获得最佳碳源和氮源的基础上，进行多组试验摸索碳氮用量的最佳比例。改变碳源及氮源的用量，其他组分不变、培养条件保持不变，按“1.2.1”方法进行摇瓶试验，大致确定最佳配比。

培养基的进一步改良：在获得一些优化培养基的主要参数后，同时考虑降低生产成本等方面的问题，对培养基配方进一步改良。使用正交试验法[9，10]，最终确定HBERC-20821的最佳发酵培养基配方。

2 结果与分析

2.1 碳源优化

进行碳源单因素试验，改变原摇瓶培养基中碳源成分，其他组分、培养条件保持不变，培养方法按照“1.2.1”，检测方法按照“1.2.3”。试验结果如表1、图1所示。

由不同碳源的HPLC检测结果可以看出，HBERC-20821对葡萄糖和糖蜜的吸收和利用要优于其他碳源。HBERC-20821对于蔗糖和甘油利用效果不佳。镜检结果也与HPLC检测结果相符。根据产物产量对几种碳源进行排序，依次为糖蜜、葡萄糖、甘露醇、甘露醇*、饴糖、可溶性淀粉。综合考虑培养基成本和配制培养基的方便程度考虑，确定葡萄糖为最佳碳源。

2.2 氮源优化

改变摇瓶培养基中氮源成分，使用葡萄糖作为氮源，其他组分、培养条件保持不变，培养方法按照“1.2.1”，检测方法按照“1.2.3”。试验结果如表2、图2所示。

由不同氮源的HPLC检测结果可以看出，HBERC-20821对酵母浸粉的吸收和利用要明显好于其他氮源。根据诺沃霉素产量，将几种氮源进行排序，由多到少依次为酵母浸粉、玉米浆、黄豆粕、豆饼、大豆蛋白胨、棉子粉、玉米粉、硫酸铵。HBERC-20821对于不溶性和无机氮源的利用效果不佳。由以上试验结果确定酵母浸粉为最佳氮源。

2.3 碳氮源最佳比例的探索

在进行碳源、氮源单因素试验确定最佳碳氮源后。进行多组试验摸索碳氮用量的最佳比例，试验培养基配方见表3。

只改变原摇瓶培养基中碳源与氮源的用量，其他组分、培养条件保持不变，培养方法按照“1.2.1”，检测方法按照“1.2.3”。试验结果如表4、图3所示。

根据HPLC检测结果，组别4和6中产物产量极低，推测培养基中碳源含量高于4%，氮源含量高于2%时菌株代谢将会明显受到影响。最适宜HBERC-20821生长的为组别5中的配方，相对于对照组中诺沃霉素产量提高了45.7%，即最适碳氮源比为4∶1。在摇瓶水平上，获得HBERC-20821最高产量的配方为：葡萄糖4.0%，酵母浸粉1.0%，磷酸氢二钾0.035%，碳酸钙0.05%，豆油0.1%。

2.4 碳氮源正交试验

通过上面的试验已经获得了HBERC-20821生长的最佳碳源、氮源及其比例，但由于酵母浸粉作为氮源成本相对较高，从降低生产成本考虑，在保证较高产量的条件下使用更为廉价的豆粕代替部分酵母浸粉作为该菌生长所需的氮源。使用正交试验法进一步改良培养基，试验因素水平设置见表5，试验结果见表6。

按照因素水平设置表，改变原摇瓶培养基中碳源与氮源的用量，其他组分、培养条件保持不变，培养方法按照“1.2.1”，检测方法按照“1.2.3”。

L9（33）试验结果见表6，由表6可知，影响程度由R值可知：B>A>C，即在葡萄糖、酵母浸粉、豆粕三种影响因素中，酵母浸粉影响因素最大。由表6可知，诺沃霉素A+B峰面积最大值为编号8，即产量最高的组合为A3B2C1。

综合以上结果，可以得出HBERC-20821最佳发酵配方为：葡萄糖4.0%，酵母浸粉0.5%，豆粕1.0%，磷酸氢二钾0.035%，碳酸钙0.05%，豆油0.1%。改良过的培养基相对于原配方培养基，诺沃霉素产量提高了657%。

3 小结与讨论

通过碳氮源单因素试验获得植生链霉菌HBERC-20821最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母浸粉。通过多组试验确定碳氮源的最佳比例约为4∶1。根据前面试验获得的相关参数，优化后的发酵培养基配方为：葡萄糖4.0%，酵母浸粉0.5%，豆粕1.0%，磷酸氢二钾0.035%，碳酸钙0.05%，豆油0.1%。根据HPLC检测结果，在最佳发酵条件下，诺沃霉素产量比对照培养基提高了657%。

本试验仅对诺沃霉素摇瓶发酵培养基的配方进行优化，其他发酵参数如pH、接种量、发酵温度、搅拌、发酵时间等也会对发酵产生重要影响。下一步的发酵工作，将在小型自动发酵罐上进行，以优化发酵工艺，并进行中试放大，将诺沃霉素向产业化方向推进。

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[10] 李春喜，王志和，王文林.生物统计学[M].北京：科学出版社，2002.