一株短短芽孢杆菌X23培养基优化及其抑菌活性研究

摘 要：通过平板对峙培养试验发现短短芽孢杆菌X23对细菌、真菌、卵菌等多种植物病原菌都有拮抗作用，在NB培养基基础上通过单因素变量法进行优化，并对发酵液稳定性进行研究。结果表明：当培养基中牛肉膏1 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L时，发酵液抑菌效果最好。60和70℃加热处理1 h的发酵液抑菌活性不变，80℃以上抑菌活性下降，100℃以上活性丧失；不同pH值中过夜处理，抑菌活性不降低；紫外光照2～8 h抑菌活性不变，10 h以上活性下降。试验证明抑菌活性物质具有良好的耐热性，耐酸碱性以及紫外稳定性。

关键词：短短芽孢杆菌；抑菌活性物质；生物防治

中图分类号：S432 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2014）11-0001-02

现代农业生产中，化学农药的使用还占据着主导地位，长期使用化学农药破坏了生态环境[1]，使病原菌产生抗药性，因此开发生物农药、利用微生物进行生物防治迫在眉睫。微生物是生物农药的重要来源之一，而芽孢杆菌是植物病害生物防治的重要生防资源，芽孢杆菌菌体本身及其产生的抑菌活性物质除了能抑制病原菌的生长，在促进植株生长等方面也有良好的表现，在植物病害生物防治中具有潜在的应用价值和广阔的应用前景[2]。芽孢杆菌产生的芽孢耐热耐干旱能力强，越来越受到人们的关注[3-5]。研究对青枯病菌具有较强拮抗作用的生防菌X23 进行抑菌谱测定，对其活性物质进行稳定性分析，以期为X23的进一步研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌 株

拮抗菌：短短芽孢杆菌X23（Brevibacillus brevis）；病原菌：大肠杆菌（Escherichia Coli DH5а）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）、金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata ）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae ），由湖南农业大学重点实验室提供；指示菌：青枯病菌（Ralstonia solanacearum GMI1000），由中国农科院植物保护研究所惠赠。

1.2 试 剂

牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、酵母提取物 、胰蛋白胨、葡萄糖、氢氧化钠、氯仿、盐酸等（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯 200 g/L、葡萄糖20 g/L，加蒸馏水定容至 1 000 mL；NB培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠5 g/L，加蒸馏水定容至 1 000 mL，pH值7.0～7.2；番茄燕麦培养基：燕麦 30 g/L、番茄汁 150 mL/L、琼脂 15 g/L，加蒸馏水定容至 1 000 mL。

1.4 无菌发酵液制备

将X23接种到改良NB培养基中培养（180 r/min， 28℃）36 h后，4℃ 7 000 r/min 离心10 min，取上清液，使用0.22 μm过滤器过滤，无菌滤液置于4℃冰箱备用。

1.5 发酵液抑菌活性

采用平板对峙法，病原细菌培养至OD值达到1.5以上时，取0.2 μL青枯菌液加入1 mL无菌水中，混匀后取30 μL加入50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基20 mL，上下颠倒混匀，倒板，冷却，再用打孔器打孔，每孔加入100 μL无菌发酵液，置于37℃恒温培养箱培养10～12 h观察结果。其他病原菌取菌饼于合适培养基中培养，在距离菌饼1 cm处打孔加入100 μL无菌发酵液，28℃恒温培养箱培养2～3 d观察结果。

1.6 培养基优化

以改良的NB培养基为基础，对培养基进行简单优化，之前预试验对葡萄糖用量设置不同水平发现只有当葡萄糖量保持在10 g/L时发酵液抑菌活性最好，所以对牛肉膏和蛋白胨的用量设置不同水平，采用单一元素变化的方法，牛肉膏分别设为1、2和3 g，蛋白胨则设为1、2、3、4和5 g，通过平板对峙培养比较不同成分处理的培养基发酵液的抑菌活性。

1.7 发酵液稳定性

1.7.1 热稳定性 取1 mL无菌发酵液于2 mL灭菌的离心管中，分别置于60、70、80、90、100℃水浴锅中处理1 h，在121℃高压灭菌锅中处理1 h。以原始发酵液为对照，通过平板对峙培养进行抑菌活性的检测，每个处理设置3组重复，对照抑菌活性设为100%。

1.7.2 酸碱稳定性 将无菌发酵液的pH值调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0与10.0，放入4℃冰箱过夜再调回原始发酵液正常的pH值，以原始发酵液为对照，通过平板对峙培养进行抑菌活性的检测，每个处理设置3组重复，对照抑菌活性设为100%。

1.7.3 紫外稳定性 将无菌发酵液在20W的紫外灯下分别照射2、4、6、8、10、12与24 h。以不进行紫外灯处理的原始发酵液为空白对照，取处理后的发酵液通过平板对峙培养检测抑菌活性，每个处理设3组重复，对照抑菌活性设为100%。

1.8 抑菌率的计算

通过计算抑菌率来判断抑菌活性物质的稳定性强弱，计算公式如下：

抑菌率=处理后发酵液的抑菌半径/未处理发酵液的抑菌半径

2 结果与分析

2.1 发酵液活性分析

平板对峙培养试验结果表明，X23发酵液对青枯病菌、大肠杆菌、烟草黑胫病菌、金黄色葡萄球菌、烟草赤星病菌、稻瘟病菌都有抑菌效果。经过观察发现，平板放置2 d后，抑菌圈内没有重新长出青枯菌，说明抑菌物质抑菌效果稳定。

2.2 X23发酵培养基优化

X23接种于不同培养基中，在相同的发酵条件（180 r/min，28℃）下培养36 h，平板对峙培养后测量抑菌圈大小，比较各培养基发酵液的抑菌活性强弱。测定抑菌圈直径大小如表1所示。

试验结果显示，当牛肉膏为1.2 g/L，蛋白胨为5 g/L，葡萄糖为10 g/L时，发酵液抑菌效果是最好的。从其他6个处理的结果来看，牛肉膏和蛋白胨的量变化都会对发酵液的抑菌活性有明显的影响。

2.3 发酵液稳定性

2.3.1 热稳定性 从图1可知，经过1 h不同热处理的无菌发酵液的抑菌率有一定差异，60和70℃处理的发酵液抑菌率和原液一样，80℃以上的处理抑菌率开始下降，其中80℃处理抑菌率保持有91%，90℃处理抑菌率则明显下降，100及121℃处理1 h后活性丧失，由此可见，发酵液中活性物质在一定的温度范围内具有耐热性，温度过高则会使抑菌活性丧失。

2.3.2 酸碱稳定性 从图2中可以看出，无菌发酵液在不同pH值中过夜处理，其抑菌活性均没有降低，抑菌率均保持在100%，说明发酵液中的抑菌活性物质具有很好的耐酸碱性。

2.3.3 紫外稳定性 由图3可知，在20W的紫外灯照射

时间处理下，发现2～8 h内发酵液抑菌效果和原液无差异，10 h以上抑菌率开始下降，经过24 h紫外照射后抑菌率还保持在85%以上，说明发酵液中的抑菌活性物质对紫外线照射不敏感，稳定性好。

3 结论与讨论

平板对峙试验结果表明，菌株X23发酵液对多种植物病原菌都有很好的抑制作用，而且抑菌物质抗菌效果稳定。通过优化培养基，大大提高了代谢物质产量，活性物质在分离纯化的过程中，目的产物的活性可能发生变化，造成这种变化的原因较多，可能被菌株自身产生的酶分解或者因分离纯化过程中受到温度、溶液pH值变化、日光中紫外线照射等的影响而改变了活性。在分离纯化过程中，要将保持物质活性放在首要位置，试验表明，抑菌活性物质具有良好的耐热性，耐酸碱性以及紫外稳定性。这为后续分离纯化过程中选择分离条件提供了参考。

试验对X23的发酵液抑菌活性进行了初步研究，但是其具体的活性物质还要进一步分离纯化，作用机制也还有待深入研究。使用拮抗微生物对植物病害进行生物防治，可以有效地减少化学农药污染残留，而且不易诱导病原菌产生耐药性。后续试验可以对发酵液中的物质进行分离纯化并探索其抑菌机理，发掘该菌在农业生产上的潜在应用价值，为微生物防治提供新的思路。

参考文献：

[1] Schallmey M，Singh A，Ward O P. Developments in the use of Bacillus species for industrial production[J]. Canadian Journal of Microbiology，2004，50（1）：1-17.

[2] 王 静，赵廷昌，孔凡玉，等. 枯草芽孢杆菌SH7 抑菌物质及其特性[J]. 植物保护学报，2007，34（4）：443-444.

[3] 吴秀红，张新中，周永灿，等. 关于芽孢杆菌Bacillus 应用概述[J]. 现代渔业信息，2007，22（7） ：47-55.

[4] Zhou Q X， Song Y F， Sun T H. Study progress of bioremediation’s application[J]. Prog. Nat. Sci.，2004，14（7）：721-728.

[5] 张艳群，来航线，韦小敏，等. 生物肥料多功能芽孢杆菌的筛选及其作用机理研究[J]. 植物营养与肥料学报，2013，19（2）：489-497.

（责任编辑：高国赋）