诱杀植物香根草对稻蛀茎夜蛾幼虫解毒酶和乙酰胆碱酯酶的影响

V�����-��ڝ�"r���h�&az8��iצʇ�����[n��Rr'�q�jx3����M6�(b���e�j�!jp �'.�۫jPn�����.f��&����)�xv��8h�mu�M†)���@n�ki����z���������W�������ͩ�'^��.�ן}�-���ɫm��-}隕杺[l������j)�z����%k'���!�W���~�k�x%j��y�.����&�W�z�^��b}�2rW�i�^���v)�{޶+ެ�y�h����h�j����^j�az�r�*%��jV�u��r��ƥy��r���b��ځ����azV����}(�}�ޞ�u�^�h�y�ay�-�����(~�^u�h�'�q�b�w��)����iǭ�W!�X�z�^��(D������z{%j��y��z��yا���zدz��v��y8^��.��,��v�Z��&���w���^���i��v��ǭ�朶+�'���^��b~'�*'z|��%�֭�*'y+kj{z��xd����(D��޲('���j{e�)ܭ�yا��j��y���{޶+ެz0z����{���"�x��Ƨ�؟}�ޝǢ�ƫn�r��-z��x&���s+hr����Krد�؞�8^$�i�b�+r�{ay�.��b��Z�V������ax��-����)��r�݊{-j�Z���}�h����������]�~�]�(!z�aj{a�Ǣ��^���i��v��Ǔ����.��"�؜jם����b���k(Z��(�朶+޲�쵩�z�+��(�֫�g�i�%�׬��-jw��Z�)ݹǝ$�jwBj�rد�؞�)��Z���}�h���������f�m�'z���r��ɬ~�ޙ��zw2i֩��b�zJ)�z�����{-��b��ӆ+,��r��������jب��+~���ޖ�"u�b�az�r�*%��jV�u��r��ƥy��r���b��ځ����azV����}(�}�ޞƧv��'^��az�޶'�������^u�ޖ�fz{h~ˬ���i�^r����my�g�Z ��+J)�z�����y�'����i�����b��➸�y�(�+-zo���i)찢�l��RzƦ���}�ޞ�^�+ޮ&��6����z�^��b~'�*'z|��zܥr%�w���ڱ�kj�ej{������j)�z���f����z����^��hrۢu��U�b���k8�jx��׬.)�5�!�駎zq�ۣ�z�^�� ��?�t�[�j�b�w�������jdžI;;��)\��b��-z��x���u���iըky"http://www.wufanghuizhong.com/p/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法

1.1供试植物

水稻品种‘浙优12号’购自浙江省农科种业有限公司。播种于温室塑料槽内，约30 d后移栽至直径为12 cm的塑料盆中，至45 d分蘖期时剪取茎秆用于稻蛀茎夜蛾幼虫的饲喂试验。

香根草种苗购自深圳市鑫淼森园林草坪有限公司。将香根草种苗种于温室，以分蘖苗作为繁殖体，待香根草分蘖较多时剪取茎秆用于稻蛀茎夜蛾幼虫的饲喂试验。

1.2供試昆虫

稻蛀茎夜蛾种群于2014年5月采自杭州市萧山区义桥镇（30°04′ N，120°12′ E）水稻田，室内建立并维持种群，幼虫采用人工饲料饲养，饲料配方由中国水稻研究所提供[13]，置于温度（27±2）℃，相对湿度（70±5）%，光周期L∥D=16 h∥8 h的智能人工气候室内饲养。待稻蛀茎夜蛾化蛹后将蛹收集起来，放置在干净的养虫笼中，保湿，让其继续发育羽化，对羽化后的成虫以10%的蜂蜜水提供营养。

选取初孵幼虫用于水稻（对照）和香根草的饲喂试验。当水稻饲喂的幼虫达1、2、3、4龄时，对水稻和香根草饲喂的幼虫分别进行取样，幼虫饥饿3 h后，在液氮中速冻并立即转至-80℃冰箱中保存，供后续酶活性测定试验用。试验中每处理各重复3次。

1.3取食水稻和香根草后稻蛀茎夜蛾幼虫体内解毒酶活性测定

CarE活性测定：参照Lu等[7]的方法稍加改进。每个样品称取100 mg，加入pH 7.0的PBS 1 mL，充分匀浆后，在4℃，12 000×g条件下离心15 min，取上清液40 μL加入酶标板中，每孔加入100 μL底物与显色剂的混合液（含0.2 mol/L、pH6.0的PBS，10 mmol/L α乙酸萘酯和1 mmol/L固蓝RR盐，混合后过滤）。然后加入5 μL酶液和45 μL 0.1 mol/L、pH 7.6的PBS，利用动力学方法测定10 min内OD450值变化，以反应速度mol/（min·mg）表示酶活力。

GSTs活性测定：参照Habig等[14]的方法稍加改进。用0.1 mol/L，pH 6.5的PBS制备酶液，在96孔酶标板中每孔依次加入45 μL PBS、5 μL酶液（制备方法同蛋白酶）、50 μL 1.2 mmol/L的1氯2，4二硝基苯（CDNB）和50 μL 6 mmol/L的还原型谷胱甘肽（GSH）。利用动力学方法测定10 min内OD340值变化，以反应速度nmol/（min·mg）表示酶活力。

细胞色素P450酶活性测定：参考Rose等[15]的方法稍加改进。利用0.1 mol/L、pH 7.6、含1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L苯基硫，1 mmol/L PMSF的PBS制备酶液。在96孔酶标板中依次加入2 μmol/L对硝基苯甲醚（溶解于0.1 mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液）50 μL，9.6 mmol/L的NADPH 5 μL和45 μL制备好的酶液。利用动力学方法测定10 min内OD405值变化，以反应速度nmol/（min·mg）表示酶活力。

1.4取食水稻和香根草后稻蛀茎夜蛾幼虫体内AChE活性测定

AChE活性测定：参照Ellman[16]的方法并稍加改进。将稻蛀茎夜蛾幼虫利用0.1 mol/L，pH 7.5的PBS充分匀浆，匀浆液于4℃，12 000×g条件下离心15 min，取50 μL酶液加入酶标板中，依次加入100 μL碘化硫代乙酰胆碱ATChI（0.5 mmol/L）、100 μL DTNB溶液（20 mmol/L）混合后，利用酶标仪测OD405。以反应速度mol/（min·mg）表示酶活力。

1.5蛋白含量測定

利用Bradford[17]的考马斯亮蓝G250法测定酶提取液中的蛋白含量，用于酶活性计算。

1.6数据处理

采用SPSS 17.0软件进行数据的统计分析，并采用T测验进行数据的差异显著性分析。

2结果与分析

2.1稻蛀茎夜蛾幼虫取食香根草后体内解毒酶活性

稻蛀茎夜蛾在取食水稻和香根草后，1～4龄幼虫体内CarE比活力无显著差异（表1）。

2.2稻蛀茎夜蛾幼虫取食香根草后体内AChE活性

取食香根草后的2～4龄稻蛀茎夜蛾幼虫体内AChE比活力显著高于取食水稻的，且在2龄时两者差异最显著，取食香根草约为取食水稻上AChE比活力的2.9倍（表4）。

3讨论

香根草作为诱杀植物防治水稻螟虫已成为稻螟绿色防控的重要措施之一，具有很大的开发潜力[2， 18-20]。笔者前期研究表明，二化螟Chilo suppressalis幼虫取食香根草后体内CarE和细胞色素P450酶的活性显著下降[12]。为了进一步明确香根草在生理、生化水平上对稻蛀茎夜蛾幼虫的影响，我们测定了取食香根草后稻蛀茎夜蛾幼虫体内3种重要解毒酶和AChE酶的活性变化。

昆虫取食寄主植物后，解毒酶系统会发生明显改变，包括酶的诱导作用等[56]。寄主植物中的毒素或次生物质在昆虫体内的降解主要依靠解毒酶，昆虫体内的解毒酶系主要是以GSTs、CarE、细胞色素P450酶为主，这些酶系对维持昆虫体内正常的生理代谢功能和分解外源毒物都起着重要作用[21]。本文研究结果表明，取食香根草后稻蛀茎夜蛾幼虫GSTs活性显著升高，说明GSTs在稻蛀茎夜蛾对香根草的解毒代谢中发挥着重要作用。关于寄主植物诱导解毒酶活性的研究很多，吕朝军等[22]研究发现：取食苹果树的苹果黄蚜Aphis citricola的CarE活性显著高于取食梨树、李树和杏树的苹果黄蚜的CarE活性，推测这可能与寄主植物体内次生代谢物的种类不同相关。林佳和谢佳燕发现取食鹅观草的禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi与取食小麦和燕麦的禾谷缢管蚜酯酶活性存在显著差异[4]。安志兰等发现取食番茄、一品红、棉花和茄子的烟粉虱Bemisia tabaci CarE、GSTs等解毒酶均存在显著差异[11]。此外，李飞等研究发现：害虫能够通过改变自身的解毒酶或AChE的特性等方式不断适应寄主植物体内产生的次生代谢物[23]。稻蛀茎夜蛾取食香根草后，AChE活性显著上升，可能是稻蛀茎夜蛾取食香根草后应急防御机制之一。也有研究表明，取食茄子的烟粉虱AChE活性分布与取食番茄的明显不同[11]；取食马铃薯、玉米、藜和大豆后对草地螟Loxostege sticticalis中肠AChE活性影响显著[24]；番茄、四季豆、苦瓜等寄主植物对南美斑潜蝇Liriomyza huidobrensis AChE活性影响显著[10]。

解毒酶和AChE是昆虫体内重要的生化物质，取食不同寄主植物能够改变昆虫解毒酶或AChE活性。由于目前并无香根草内杀虫活性物质鉴定及香根草对稻蛀茎夜蛾幼虫致死作用机制的相关报道，我们推测可能是香根草内的次生物质或者有毒活性成分诱导或激活了稻蛀茎夜蛾体内与解毒代谢相关酶的表达，这也是昆虫对寄主植物的应急防御机制之一，但是这种现象是否能引起稻蛀茎夜蛾对香根草的完全适应，使其成为替代寄主，或者是否影响稻蛀茎夜蛾的耐药性仍有待进一步研究探讨。此研究结果为深入阐明香根草对稻蛀茎夜蛾幼虫生理生化水平的影响，为开发以香根草为基础的稻蛀茎夜蛾绿色防控新技术提供理论依据。

参考文献

[1]赵钧，付文曦，韩召军.大螟对7种杀虫剂的抗药性监测及相对敏感基线验证[J].南京农业大学学报，2016，39（1）：8488.

[2]Lu Zhongxian， Zhu Pingyang， Gurr G M， et al. Rice pest management by ecological engineering： a pioneering attempt in China [M]∥Heong K L， Cheng Jiaan， Escalada M M.Rice planthoppers： ecology， management， socioeconomics and policy.Springer，2015：161178.

[3]梁齐， 鲁艳辉， 王国荣， 等. 寄主植物喷药对大螟产卵选择性的影响[J]. 植物保护学报， 2017， 44（1）：3944.

[4]林佳， 谢佳燕. 不同植物对禾谷缢管蚜酯酶和乙酰胆碱酯酶活性的诱导作用[J]. 植物保护， 2014， 40（4）： 115117.

[5]高希武. 寄主植物对棉蚜羧酸酯酶活性的影响[J]. 昆虫学报， 1992， 35（3）： 267272.

[6]Riskallah M R， Dauterman W C， Hodgson E.Host plant induction of microsomal monooxygenase activity in relation to diazinon metabolism and toxicity in larvae of the tobacco budworm Heliothis virescens （F.）[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 1986， 25（2）： 233247.

[7]Lu Y H， Gao X W. Multiple mechanisms responsible for differential susceptibilities of Sitobion avenae （Fabricius） and Rhopalo siphumpadi （Linnaeus） to pirimicarb [J]. Bulletin of Entomological Research， 2009， 99（6）： 611617.

[8]Lindroth R L. Host plant alteration of detoxification activity in Papilio glaucus [J]. Entomologia Experimentalis et Applicata， 1989， 50（11）： 2935.

[9]李腾武， 宗静， 高希武， 等. 寄主植物对桃蚜羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的诱导作用[J]. 植物保护， 1997， 23（2）： 1416.

[10]魏秋学， 何玉仙， 杨秀娟， 等. 寄主植物对南美斑潜蝇羧酸酯酶及乙酰胆碱酯酶活力的影响[J]. 江西农业大学学报， 2004， 26（3）： 345347.

[11]安志兰，褚栋，郭篤发，等.寄主植物对B型烟粉虱（Bemisiatabaci）几种主要解毒酶活性的影响[J].生态学报，2008，28（4）： 15361543.

[12]鲁艳辉， 高广春， 郑许松， 等. 诱集植物香根草对二化螟幼虫致死的作用机制[J]. 中国农业科学， 2017， 50（3）： 486495.

[13]傅强， 袁哲明， 戴长庚， 等. 一种大螟的半人工饲料及制备方法： CN103110009A [P].20130522.

[14]Habig W H， Pabst J， Jackoby W B.Glutathione Stransferases： the first enzymatic step in mercapturic acid formation [J]. Journal of Biological Chemistry， 1974， 249（22）： 71307139.

[15]Rose R L， Barbhaiya L， Roe R M， et al. Cytochrome P450associated insecticide resistance and the development of biochemical diagnostic assays in Heliothis virescens [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 1995， 51（3）： 178191.

[16]Ellman G L， Courtey D， Andres V， et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterease activity [J]. Biochemical Pharmacology，1961， 7（2）： 8895.

[17]Bradford M M A.A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding [J]. Analytical Biochemistry， 1976， 25（1）：248256.

[18]夏岳章， 孙文岳. 香根草对水稻螟虫的诱杀及应用[J]. 浙江农业科学， 2012（12）： 16931695， 1698.

[19]赵中华， 杨普云. 2011年全国农作物病虫害绿色防控工作进展[J]. 中国植保导刊， 2012， 32（8）： 1719.

[20]陈桂华， 朱平阳， 郑许松， 等. 应用生态工程控制水稻害虫技术在金华的实践[J]. 中国植保导刊， 2016， 36（1）： 3136.

[21]陈长琨. 昆虫生理生化实验[M]. 北京： 农业出版社， 1993.

[22]吕朝军，韩巨才，刘慧平，等.寄主植物对苹果黄蚜药剂敏感性及解毒酶活性的影响[J].植物保护学报，2007，34（5）：534538.

[23]李飞， 韩召军， 吴智锋， 等. 我国棉蚜抗药性研究现状[J]. 棉花学报， 2001， 13（2）： 121124.

[24]尹姣， 冯红林， 李克斌， 等. 寄主植物对草地螟中肠解毒酶及保护性酶活性的影响[J]. 植物保护， 2012， 38（1）： 3539.

（责任编辑：田喆）