筛选和利用海洋细菌防治玉米纹枯病试验

摘要：从江苏省南通市沿海滩涂、近海海水、海藻体内分离到了862株海洋细菌，以玉米纹枯菌为指示菌对其抑菌活性进行检测，经初筛、复筛、定量复筛，获得7株抑菌效果较好的拮抗细菌，并对筛选出的高效拮抗菌株进行室内抑菌及田间防病测定试验。结果表明， NH-8菌株的拮抗活性和防效最强，通过形态特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析，初步鉴定该菌株为芽孢杆菌。

关键词：海洋细菌；玉米纹枯病；芽孢杆菌

中图分类号：S435.131.4+9 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0118-03

玉米纹枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）侵染所致的土传病害。在我国，玉米纹枯病最早于1966年仅吉林省有发生记载，继吉林省之后，辽宁省、湖北省、广西壮族自治区、河南省、山西省、浙江省、陕西省、河北省、四川省、山东省、江苏省等省（区）均陆续有玉米纹枯病发生的报道^[1]。近年来，随着玉米感病品种的种植与推广，玉米纹枯病发生与危害日趋严重，已成为玉米高产、稳产的主要限制因子之一^[2]。由于纹枯病菌腐生能力强、寄主范围很广，国内外至今尚未发现该病的高抗玉米品种，生产中主要采用化学杀菌剂进行防治^[3-4]。长期连续使用化学农药，容易导致病菌产生抗药性。生物防治用生态学方法控制有害生物，避免使用化学农药带来的一系列环境、能源问题，促进农业可持续发展^[5-8]。随着研究的深入，从陆生资源中分离筛选出新的有效生防资源菌变得越来越困难，探索新的生防资源迫在眉睫。海洋微生物由于其生长环境很特殊而受到学者们的关注，已有从海洋中分离筛选出植物病害生防微生物的报道^[9-11]。但筛选利用海洋细菌用于玉米纹枯病的生物防治目前尚未见报道。本研究从江苏省南通市沿海滩涂近海海水及海藻中分离筛选到多株对玉米纹枯病菌具有较强拮抗性能的海洋生防细菌，旨在为防治植物病害提供新的生防资源。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

样品采集点为南通市沿海滩涂、近海海水、海藻体内。沿海滩涂取植物根际土壤，近海海水取样地点距海岸1～2 km，选取多点采样。将样品密封于灭菌的容器，带回实验室4 ℃保存^[12]。

1.2 供试病原菌

玉米纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、小麦全蚀病菌（Gaetanannomyces graminis）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.vasinfectum）、小麦根腐病菌（Helminthosporium sorokianum）由笔者所在实验室提供。花椰菜根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicicola）菌株由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。玉米品系YQ7-96 由广西大学农学院吴子恺教授提供。

1.3 供试培养基

海水PYS培养基：蛋白胨5 g、酵母膏5 g、MgCl2·2H2O 2 g、葡萄糖5 g、NaCl 16 g、陈海水1 000 mL，用于拮抗细菌的分离、纯化、培养^[13-14] 。PDA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL，用于植物病原真菌培养。培养基pH值均为7.0～7.2。

1.4 拮抗细菌的筛选

1.4.1 细菌分离 用稀释法分离海洋细菌，将分离物平板置于26 ℃培养箱中培养72 h，挑取单菌落纯化，移植斜面保存于PYS培养基中。

1.4.2 初筛 以玉米纹枯病菌为指示菌，采用平板对峙法^[15]筛选拮抗菌株。将纹枯菌移植到PDA平板上，26 ℃培养48 h，用打孔器在带菌PDA平板上打孔，在不带菌的PDA平板上呈对角点接海洋细菌，24 h后在平板中央移入纹枯菌菌盘，26 ℃下培养48 h，测量拮抗带宽度。每处理重复3次，对抑菌作用快且强的海洋细菌进行定量复筛。

1.4.3 复筛 将初筛菌株移植到海水PYS培养基中，培养液在26 ℃、140 r/min条件下振荡培养48 h，用移液枪移取 10 μL 菌液，滴在PDA平板上直径约6 cm的灭菌滤纸片上，进行定量复筛。测量抑菌圈半径，抑菌率计算公式如下：

抑菌率=（2×抑菌圈半径）/45×100%。

1.5 拮抗菌株鉴定

1.5.1 生理生化鉴定、形态学观察 对复筛得到的1株抑菌率为87.1%的拮抗菌株NH-8进行革兰氏染色、接触酶反应、淀粉水解、好氧性试验、明胶液化、耐盐性试验、50 ℃生长等生理生化试验 ^[16-17]。

1.5.2 16S rDNA序列分析鉴定 以拮抗菌株BH-01总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物F27 （5′-AGAGTITGATCATGGCTCAG-3′） 和R1492（5′-GCTACCTTGTTACGACTT-3′） 进行PCR扩增，反应条件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。将PCR产物检测、回收、连接、转化、阳性克隆，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将菌株的16S rDNA序列与GenBank核酸序列数据库中的序列进行比对，回收、纯化扩增产物后进行测序，利用NCBI数据库的BLAST程序对测序结果进行同源性检索，与GenBank数据进行比对分析。

1.6 拮抗菌对不同植物病原真菌的拮抗性能测定

将玉米纹枯病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、小麦全蚀病菌、棉花枯萎病菌、小麦根腐病菌、花椰菜根肿病菌、白菜黑斑病菌等8种病原菌在PDA平板上活化后，将直径为 5 mm 的病菌菌块放入PDA平板中央，将NH-8在海水PYS液体培养基中振荡培养48 h，各取0.1 mL呈对角点滴4个菌株于PDA平板上，每处理重复3次，26 ℃培养。以放置病原菌而不放拮抗菌的PDA平板作为对照，当对照病原菌长满培养基时，测量抑菌圈的直径。

1.7 拮抗菌株对玉米纹枯病的防治效果

1.7.1 拮抗细菌对纹枯病菌菌丝形态及菌核形成的影响 将纹枯病病菌移植到PDA平板上，26 ℃下培养48 h；用打孔器在带菌PDA平板上打孔，在不带菌的PDA平板上呈对角点接4个滤纸片，每个上样20 μL拮抗菌悬液；24 h后在平板中央移入纹枯菌块，26 ℃下培养48 h，在显微镜（400×）下观察菌丝生长情况，继续观察对峙培养结果，记录菌核形成情况、形成时间。

1.7.2 拮抗细菌防病能力试验 选取拮抗性能较强的7株复筛菌株进行盆栽控病能力测定，每个菌株设置10个处理，1个空白对照。玉米苗期进行纹枯病菌接种，将在PDA平板活化的纹枯病菌放入灭菌的火柴梗中，待火柴梗长满菌丝后接种于玉米叶鞘；接种纹枯病菌10 h后，取20 mL拮抗菌悬液兑水500 mL喷雾，10 d后进行第2次喷雾，隔10 d进行第3次喷雾。接种处病斑扩展上下边缘长度即为病斑大小，植株基部至接种处病斑上边缘的长度即为病斑高度，基部至最高叶尖距离为株高，根据病斑大小及高度计算防效，确定拮抗菌株的防病能力。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌筛选

从南通市沿海滩涂、近海海水、海藻中共分离得到862株海洋细菌，其中有83株对玉米纹枯病菌具有不同程度的拮抗作用，占分离总菌株的9.6%，其中，来自沿海滩涂、海藻、近海海水的拮抗菌株分别占所有拮抗菌株的19.25%、12.13%、27.75%。通过复筛及定量复筛，获得7株玉米纹枯病抑制率在51%以上的拮抗菌株。由表1可见，菌株NH-8的拮抗带宽19.6 mm，对玉米纹枯病病菌的抑菌效果最好，抑菌率高达87.1%（图1）。

2.2 菌株NH-8鉴定

2.2.1 形态学鉴定观察 菌株NH-8革兰氏染色呈阳性，菌体为杆状，在PYS培养基上26 ℃培养24 h后产生芽孢，芽孢呈椭圆形，中生。培养初期菌落为圆环形、乳白色，边缘整齐，菌落隆起，呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落为淡黄色，边缘呈小齿状，表面干燥有褶皱。在液体培养基中静止培养时，菌体在培养基表面形成白色菌膜。结合《常见细菌系统

2.2.3 NH-8菌株16S rDNA鉴定 提取NH-8菌株DNA进行PCR扩增，测序结果表明，菌株16S rDNA序列长度为l 510 bp。将测序结果（GenBank登录号为DF520956）与 NCBI 中芽抱杆菌16S rDNA 基因序列进行同源性比较，菌株 16S rDNA 序列与枯草芽孢杆菌16S rDNA序列同源性达99%。

2.3 拮抗菌株对不同植物病原菌的拮抗作用

由表3可见， 7个活性较好的拮抗菌株对其他供试植物不同病原菌的拮抗性能不同。NH-8菌株对玉米纹枯病菌、油菜菌核病菌、花椰菜根肿病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌的拮抗作用与其他拮抗菌比有显著差异；但对小麦全蚀病菌、白菜黑斑病菌的拮抗作用与其他拮抗菌比多没有显著差异。以玉米纹枯病菌为指示菌筛选获得的拮抗菌株在供试中表现出对花椰菜根肿病菌有较强的抑制作用，为该病害的生物防治提供了很好的拮抗材料。复筛出的海洋源细菌具有抗菌谱广、抑菌活性强的特点，表明从海洋中分离筛选活性强的菌株用于防治植物病害是切实可行的。

3 结论与讨论

海洋源微生物由于长期在海洋中生存繁殖，产生了不同于陆源微生物的新型活性物质，为医用、农用抗生素的开发提供了丰富的资源 ^[18]。筛选应用海洋源微生物进行植物病害防治虽起步较晚，但研究应用前景良好。何培青等从海洋细菌中筛选到一株对多种植物病原真菌具有显著抑制或溶菌作用的芽孢杆菌B-9987^[19]。胡江春等从海洋中分离筛选到一株能在重茬大豆根际成功定殖、对克服重茬大豆连作障碍具有明显作用的海洋放线菌MB97^[10]。本研究分离筛选到多株对玉米纹枯病菌具有较强拮抗性能的海洋生防细菌，复筛获得7株对纹枯病抑制率在51%以上的拮抗菌株，其中菌株NH-8抑菌率最高，进一步证明海洋有着丰富的微生物资源，同时NH-8菌株对蔬菜土传病害花椰菜根肿病有较强的抑制作用及防病效果，应用前景广阔。关于NH-8菌株活性物质、防病菌剂的研制及其防病机制等，还有待进一步研究。

参考文献：

[1]周文亮，程伟东，许鸿源，等. 玉米纹枯病的研究现状及问题[J]. 中国农学通报，2005（6）：331-336.

[2]黄明波，谭 君，杨俊品，等. 玉米纹枯病研究进展[J]. 西南农业学报，2007，20（2）：209-213.

[3]薛元海，施仁明，朱顺山. 适乐时、立克秀拌种防治小麦纹枯病的研究初报[J]. 淮阴工学院学报，2001，10（3）：37-42.

[4]任小平，谢关林，赵丽涵. 水稻纹枯病拮抗细菌的筛选与利用[J]. 植物保护学报，2005，32（4）：337-342.

[5]Mew T W， Cottyn B， Pamplona R， et al. Applying rice seed-associated antagonistic bacteria to manage rice sheath blight in developing countries[J]. Plant Disease， 2004， 88（5）：557-564.

[6]于淑池，张利平，王立安.拮抗细菌作为生物防治手段研究进展[J]. 河北农业科学，2004，8（3）：62-65.

[7]李社增，鹿秀云，张 静，等. 小麦纹枯病拮抗细菌的筛选[J]. 植物病理学报，2005，35（S1）：95-98.

[8]Whipps J M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere[J]. Journal of Experimental Botany， 2001， 52（Spec Issue）：487-511.

[9]田 黎，顾振芳，陈 杰，等. 海洋细菌B-9987菌株产生的抑菌物质及对几种植物病原真菌的作用[J]. 植物病理学报，2003，33（1）：77-80.

[10]胡江春，薛德林，王书锦，等. 大豆连作障碍研究 Ⅲ. 海洋放线菌MB-97促进连作大豆增产机理[J]. 应用生态学报，2002，13（9）：1095-1098.

[11]陈振明，何进坚，何 红，等. 红树林内生细菌的分离及拮抗菌筛选[J]. 微生物学通报，2006，33（3）：18-23.

[12]方金瑞，黄维真. 海洋极端微生物的分离及其开发研究——Ⅰ 嗜碱、嗜冷微生物的分离及其产生的活性物质 [J]. 中国海洋药物，1996（1）：5-10.

[13]Shieh W Y， Jean W D， Lin Y T， et al. Marinobacter lutaoensis sp. nov.， a thermotolerant marine bacterium isolated from a coastal hot spring in Lutao，Taiwan[J]. Canadian Journal of Microbiology， 2003， 49（4）：244-252.

[14]林永成，周世宁. 海洋微生物及其代谢产物[M]. 北京：化学工业出版社，2003：1-32.

[15]袁 军，孙福在，田宏先，等. 防治马铃薯环腐病有益内生细菌的分离和筛选[J]. 微生物学报，2002，42（3）：270-274.

[16]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.

[17]赵 斌，何绍江. 微生物学实验 [M]. 北京：科学出版社，2002.

[18]刘全永，胡江春，薛德林，等. 海洋微生物生物活性物质研究[J]. 应用生态学报，2002，13（7）：901-905.

[19]何培青，田 黎，李光友，等. 海洋细菌B-9987胞外代谢产物的纯化及抑菌机理初探[J]. 海洋与湖沼，2002，33（5）：492-498.