SATB1在食管鳞状细胞癌组织中的表达及意义

方案知情并签署知情同意书。

1.2 主要试剂和设备

兔抗人SATB1多克隆抗体购自美国Abcam公司，免疫组化试剂盒购自上海拜力生物科技公司，人食管鳞癌Eca109细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所，RPMI-1640培养液、脂质体2000转染试剂盒、胎牛血清和总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂及PCR试剂购自大连宝生物公司，SATB1及内参引物由上海生工生物公司设计合成，SATB1干扰序列、对照序列均由上海吉玛制药有限公司设计合成，MTT试剂盒购自美国Sigma公司，Transwell小室购自北京乐博生物科技公司，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 研究方法

1.3.1 鳞癌及癌旁组织中SATB1蛋白表达的检测

按照SP免疫组化试剂盒说明进行操作。将石蜡标本切片（约厚4 μm）脱蜡、梯度乙醇水化，加入体积分数为0.03的过氧化氢溶液，灭活内源性过氧化物酶，以微波加热进行抗原修复，使用山羊血清封闭15 min，加入兔抗人SATB1多克隆抗体（1∶800稀释），在4 ℃条件下过夜孵育，以PBS冲洗3次，加入二抗，37 ℃孵育60 min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木精复染，透明后封片，显微镜下观察。随机取5个高倍视野，按半定量法判定结果。按染色强度评分：0分，无着色;1分，染成淡黄色;2分，染成黄色;3分，染成棕褐色。按阳性细胞比例评分：0分，阳性细胞≤5%;1分，阳性细胞6%～25%;2分，阳性细胞26%～50%;3分，阳性细胞>50%。根据染色强度得分和阳性细胞比例得分乘积判定结果：0～1分为阴性，2～9分为阳性[8]。每张切片均由两位病理科医师采用盲法独立完成判定。

1.3.2 细胞培养及处理 Eca109细胞置于含体积分数0.10胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在含体积分数0.05 CO2的37 ℃恒温培养箱中培养，当细胞融合度>80%时进行消化、传代。取对数生长期细胞进行分组并转染：空白对照组（A组）细胞只加入培养液;siRNA-对照组（B组）细胞转染siRNA对照序列;siRNA-SATB1组（C组）细胞利用脂质体2000转染试剂盒转染SATB1基因的干扰序列。SATB1基因的干扰序列和对照序列见表1。细胞转染后继续培养48 h。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测细胞中SATB1基因表达 取3组转染后48 h细胞，裂解，提取总RNA，并检测总RNA纯度。按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，按PCR试剂盒说明书以cDNA为模板对引物进行扩增。引物序列见表2。PCR反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、30 s，53 ℃、30 s，60 ℃、30 s，连续进行40个循环。用2-△△Ct法计算细胞中SATB1基因表达量[9-10]。

1.3.4 MTT法检测细胞增殖能力 取3组细胞，消化，按每孔5×103个接种于96孔板中，继续培养。分别于培养12、24、48、72和96 h时，将MTT液20 μL加入各孔，孵育4 h，弃去上清，将二甲基亚砜150 μL加入各孔，振荡反应15 min，于酶标仪上检测490 nm波长处各孔吸光度（A）值[11-12]。

1.3.5 划痕实验检测细胞迁移能力 取各组细胞，消化，离心，用无血清培养液重悬细胞，按每孔105个接种于6孔板中，待细胞贴壁融合度达90%以上时，用200 μL的移液器枪头划痕，以PBS冲洗3次，去除漂浮的细胞，加入无血清培养液继续培养，分别于培养0、24和48 h时，用显微镜观察并测量划痕宽度，计算划痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h划痕宽度-24或48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.3.6 Transwell法检测细胞侵袭能力 用无血清培养液按1∶10稀释Matrigel胶，平铺于上室，风干备用。取各组转染后培养48 h细胞，用无血清培养液培养12 h，消化，用无血清培养液按109/L重悬细胞。取细胞悬液200 μL加入上室，下室则加入含体积分数0.10胎牛血清的培养液500 μL，恒温培养12 h，乙醇固定10 min，结晶紫染色，将小室内散落的细胞用棉签拭去，镜下随机取10个视野观察穿膜细胞数[13-14]。

1.4 统计学分析

使用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以[AKx-D]±s表示，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验;计数资料组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌及癌旁组织中SATB1蛋白表达

SATB1蛋白主要表达于食管鳞癌细胞核和细胞质中，以细胞质中为主，见图1。SATB1蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为78.6%，显著高于癌旁组织的38.8%（χ2=33.669，P<0.05）。

2.2 SATB1蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的关系

不同性别、年龄、部位和浸润深度的食管鳞癌组织SATB1蛋白表达差异无显著性（P>0.05）;与高分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和未发生淋巴结转移组织比较，中低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和发生淋巴结转移的食管鳞癌组织SATB1蛋白阳性表达率显著升高（χ2=14.766～27.333，P<0.05）。见表3。

2.3 各组细胞SATB1基因表达比较

SATB1 mRNA在siRNA-SATB1组、siRNA-对照组和空白对照组细胞中的相对表达量分别为1.15±0.16、9.25±1.01和9.66±1.17（n=6），差异有统计学意义（F=172.993，P<0.01）。两两比较，siRNA-SATB1组细胞SATB1 mRNA相对表达量低于siRNA-对照组和空白对照组，差异有统计学意义（t=10.915、11.117，P<0.05）。

2.4 各组细胞增殖能力比较

与siRNA-对照组和空白对照组比较，siRNA-SATB1组细胞培养24、48、72和96 h时的A值均有显著降低（F=10.286～29.154，P<0.05），提示siRNA-SATB1组细胞增殖能力被抑制。见图2。

2.5 各组细胞迁移和侵袭能力比较

siRNA-SATB1组24和48 h时划痕愈合率、侵袭细胞数均显著低于siRNA-对照组和空白对照组，差异有显著意义（F=62.696～136.852，P<0.05）。见表4、图3。

3 讨论

食管癌是临床常见的恶性肿瘤，不易早期诊断，加之肿瘤转移能力强，病人临床确诊时多数已处于中晚期，错失最佳治疗时机[15-16]。尽管近年来食管癌的临床诊疗手段不断提高，但病人5年生存率依然较低，不足30%[17]。因此，近年来食管癌研究重点集中在发现影响肿瘤侵袭、转移及复发的相关基因或分子机制，以期为食管癌治疗干预提供靶标。SATB1基因位于人染色体3p23区，与核基质结合区结合后，在调控基因转录、翻译中发挥重要的作用[18]。有研究表明，SATB1基因在多种恶性肿瘤组织中呈高表达，可作为一种基因调节因子参与肿瘤发生、进展、侵袭及转移过程[19]。有研究指出，SATB1可以通过调控影响肿瘤发生、进展的多个基因靶位，如Bcl-2、C-myc、基质金属蛋白酶（MMP）等，而改变肿瘤细胞侵袭性，从而加速肿瘤侵袭、转移[20]。本研究结果显示，食管鳞癌组织SATB1蛋白阳性表达率较癌旁组织高，表明SATB1蛋白可能发挥癌基因的作用而参与了食管鳞癌的发生。

本研究结果还显示，SATB1蛋白在中低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和发生淋巴结转移组织中的阳性表达率明显升高，表明SATB1蛋白高表达与食管鳞癌恶性程度及转移有关，提示SATB1高表达可能增强了食管鳞癌的侵袭、转移能力。为进一步探讨SATB1对食管鳞癌Eca109细胞系的影响，本研究将SATB1基因特异性沉默，观察SATB1基因沉默后食管鳞癌Eca109细胞增殖和运动能力的变化情况。结果显示，siRNA-SATB1组的SATB1 mRNA相对表达量较其他各组均有明显的降低，提示siRNA-SATB1组细胞SATB1基因表达被成功抑制。siRNA-SATB1组细胞培养24、48、72和96 h时的A值均较siRNA-对照组和空白对照组显著降低，提示抑制SATB1基因表达后，siRNA-SATB1组细胞增殖能力被显著抑制[21]。

本文研究结果还显示，siRNA-SATB1组迁移细胞数和侵袭细胞数较siRNA-对照组和空白对照组均明显降低，说明沉默SATB1基因表达后，细胞迁移和侵袭能力明显降低[22]，提示SATB1基因可能与食管鳞癌细胞迁移及侵袭过程关系密切。

综上所述，食管鳞癌组织中SATB1蛋白呈高表达，且参与肿瘤恶性进展，沉默SATB1基因可减少食管鳞癌细胞增殖，抑制鳞癌细胞迁移和侵袭，有望为食管鳞癌机制研究及基因治疗提供新的靶位。

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（本文编辑 马伟平）